鸡球虫卵囊基因组DNA提取方法.docxVIP

ICS65.020

CCSA03.21

团体标准

T/GDAAV0212—2025

鸡球虫卵囊基因组DNA提取方法

IsolationofGenomicDNAFromChickenCoccidiaOocysts

2025-12-26发布2026-01-01实施

广东省畜牧兽医学会发布

T/GDAAV0212—2025

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由广东省农业科学院动物卫生研究所、广东省畜牧兽医学会提出。

本文件由广东省畜牧兽医学会归口。

本文件起草单位：广东省农业科学院动物卫生研究所、中农华威制药股份有限公司。

本文件主要起草人：蔡海明、孙铭飞、游锡火、廖申权、戚南山、李娟、林栩慧、吕敏娜、宋勇乐、陈祥杰、朱易斌、张健騑、何钦义、曾徐浩。

T/GDAAV0212―2025

1

鸡球虫卵囊基因组DNA提取方法

1范围

本文件规定了鸡球虫卵囊基因组DNA提取方法的技术要求。

本文件适用于实验室条件下对鸡球虫病病原进行分子生物学鉴定及相关基因组分析。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SN/T4629检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适合本文件。

PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphatebufferedsaline）

TE：TE缓冲液（TEbuffer），由Tris（最常用的pH缓冲试剂）和EDTA（二价金属离子螯合剂）两种试剂组成

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammoniumbromide）

Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris(hydroxymethyl)aminoethane）

EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）

NaCl：氯化钠（Sodiumchloride）

NaAc：乙酸钠（Sodiumacetate）

OD：光密度（Opticaldensity）

5操作程序

5.1样品前处理与纯化

5.1.1粪便样品前处理与纯化

采集新鲜鸡粪样品，置于烧杯中，加入5倍～10倍体积的三级水（符合GB/T6682规定）或生理盐水，充分振荡混匀。使用2层～4层纱布或标准筛（80目或100目）过滤，去除粪渣和粗颗粒。收集滤液，1500g离心10min，弃上清。用饱和氯化钠溶液重悬沉淀，充分混匀后，以800g～1000g离心10min。卵

T/GDAAV0212—2025

2

囊会漂浮于液面。取上层液体，加入10倍～15倍体积水，混匀后1500g离心10min，弃上清。重复水洗涤步骤3次～5次，以充分去除饱和氯化钠溶液，收集处理后的卵囊沉淀备用。

5.1.2卵囊样品前处理

取约1×103个纯化后或保存于2.5%重铬酸钾溶液的鸡球虫孢子化卵囊，置于1.5mL离心管中，12000g离心5min，弃上清；沉淀以1mLPBS缓冲液洗涤3次，12000g离心5min，弃上清；沉淀以200μL20%次氯酸钠溶液重悬，混匀，冰浴条件下放置30min；沉淀以1mL无菌去离子水洗涤3次，12000g离心5min，弃上清，收集处理后的卵囊备用。

5.2样品的裂解

5.2.1玻璃珠处理法

取5.1处理后收集的卵囊沉淀，以200μLTE缓冲液（pH8.0）重悬；加入200mg直径0.8mm～1mm无菌玻璃珠，以涡旋振荡器最大转数，振荡5min～10min，显微镜下观察孢子囊和子孢子释放情况，确认卵囊壁破碎率≥95%后，取上清液；加入600μLCTAB溶液（pH8.0）、1/40体积的蛋白酶K溶液，65℃水浴作用1h，备用。

5.2.2裂解液处理法

取5.1处理后收集的卵囊沉淀，以10μL次氯酸钠溶液，4℃孵育1.5h；