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水稻温敏不育相关基因载体构建与遗传转化：分子机制与应用探索

一、引言

1.1研究背景与意义

水稻作为全球近一半人口的主食，在国家粮食安全和农业生产中占据着举足轻重的地位，在中国，超过65%的人口以水稻为主食。随着人口的持续增长以及经济的不断发展，对水稻产量和品质的需求也日益攀升。同时，面对气候变化、环境污染等因素的影响，保障粮食安全成为国家关注的焦点。提高水稻产量与品质，对于保障国计民生和粮食安全具有重大的战略意义。

杂交水稻技术是提高水稻产量的重要手段之一，其中两系杂交稻育种技术具有独特优势。两系杂交稻利用温敏不育系，在不同温度条件下表现出不同的育性，实现了不育系的“一系两用”，简化了种子生产流程，节省了资源。同时，由于温敏雄性不育系的育性受隐性核基因控制，不受亲本恢保关系限制，配组自由，恢复系资源利用范围广，更易培育出强优势杂交稻组合。据2023年农村农业部全国农作物主要品种推广情况统计数据，我国杂交水稻主要品种种植面积16128万亩，其中两系杂交水稻占8028万亩，占比达49.8%，两系杂交稻在水稻种植中占据了重要地位。

深入研究水稻温敏不育相关基因，构建其RNAi和过表达载体并进行遗传转化，对于揭示水稻温敏不育的分子机制具有重要意义。通过调控这些基因的表达，可以人为地控制水稻的育性转换，为两系杂交稻育种提供更加精准的技术支持。这有助于培育出具有更优良性状的水稻品种，如更高的产量、更好的品质、更强的抗逆性等，从而提高水稻的生产效率和质量，保障粮食安全。同时，该研究也能为其他作物的杂种优势利用和遗传改良提供理论借鉴和技术参考，推动整个农业领域的发展。

1.2国内外研究现状

在水稻温敏不育相关基因的研究方面，国内外取得了一系列重要进展。中国科学院遗传与发育生物学研究所曹晓风团队和华南农业大学庄楚雄教授团队合作研究发现TMS5编码核酸酶RNaseZS1，tms5上携带的点突变导致RNaseZS1蛋白提前终止。近期，曹晓风团队、陈宇航团队及袁隆平农业高科技股份有限公司杨远柱团队历经十余年合作研究，揭示了TMS5通过修复2′,3′-环磷-tRNA调节tRNA循环进而调控水稻温敏雄性不育的分子机制。周海/庄楚雄团队则发现了E3泛素连接酶CSIT1通过蛋白质质量控制过程调控水稻温敏雄性不育的不育起点温度的分子机制。这些研究成果为深入理解水稻温敏不育的分子机理奠定了坚实基础。

在RNAi和过表达载体构建方法的研究中，已经发展出多种成熟的技术。对于RNAi载体构建，通常需要先确定目的基因的有效靶点序列，可通过检索文献获取有实验证明有效的靶点序列，或者利用相关生物信息学工具进行预测。如从转录AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点，同时要进行序列同源性分析，排除与其他编码序列/EST同源的序列。过表达载体构建则需要将完整的目的基因克隆到合适的表达载体中，选择合适的启动子以确保基因能够高效表达。

农杆菌介导法是常用的遗传转化技术之一，具有转化频率高、可以导入大片段DNA、外源基因拷贝数通常较低、符合孟德尔遗传规律以及寄主范围广泛等优势。其原理是农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以通过共轭作用转移到植物细胞中，通过分子克隆技术将T-DNA中的致瘤基因替换为目标基因，从而实现外源基因的转移。在水稻遗传转化中，通过优化培养基成分、植物激素浓度和侵染条件等，可以显著提高转化效率。如针对籼稻愈伤组织难以培养的问题，设计全新的LY培养基，显著提高了籼稻愈伤组织的生长率和分化率；通过添加适量的植物激素，提高了籼稻组织培养再生率；通过优化侵染培养基成分、乙酰丁香酮浓度和光周期等条件，提高了农杆菌转化效率，降低了假阳性率。

尽管目前在水稻温敏不育相关基因研究及载体构建和遗传转化技术方面取得了一定成果，但仍存在一些问题和空白。部分温敏不育基因的调控网络尚未完全明晰，对于一些新发现的温敏不育相关基因，其功能和作用机制还需要深入研究。不同水稻品种对遗传转化的响应存在差异，如何提高遗传转化效率，扩大可转化品种的范围，仍是需要解决的难题。此外，在载体构建过程中，如何更加高效、准确地构建出稳定表达的载体，也是当前研究的重点之一。

1.3研究目标与内容

本研究旨在构建水稻温敏不育相关基因的RNAi和过表达载体，并通过遗传转化技术将这些载体导入水稻中，获得转基因植株，为深入研究水稻温敏不育的分子机制以及培育优良的两系杂交稻品种提供理论基础和技术支持。具体研究内容如下：

水稻温敏不育相关基因的筛选与克隆：从前期研究中筛选出的与水稻温敏不育相关的基因中，选取目标基因。通过生物信