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血细胞计数板计数法

一、计数原理与计数板结构

血细胞计数板计数法的核心原理在于将待测的细胞悬液按照一定比例稀释后，滴加到具有固定容积刻度的计数室中，在显微镜下观察并计数一定区域内的细胞数量，再根据计数室的容积、稀释倍数以及观察区域等参数，推算出原始细胞悬液中的细胞浓度。

常用的血细胞计数板通常为改良Neubauer计数板，其核心部件为位于载玻片中央的两个计数室。每个计数室被精密加工成边长为1毫米的正方形平台，平台比周围的盖玻片支持缘低0.1毫米，因此当盖玻片正确覆盖时，计数室与盖玻片之间形成一个高度为0.1毫米、面积为1平方毫米的计数空间，即容积为0.1立方毫米（μL）。

每个大计数室又进一步划分为多个中格和小格。以常见的计数板为例，中央大方格被双线划分成25个中格，而每个中格又被单线划分成16个小格，形成“25×16”的网格模式；另一种常见模式是中央大方格被划分成16个中格，每个中格再分为25个小格，即“16×25”模式。无论哪种模式，中央大方格内小格的总数均为400个。在实际操作中，通常根据细胞大小和密度选择合适的中格或小格区域进行计数。例如，计数红细胞时常选择中央大方格内四角及中央的5个中方格（共80个小格），而白细胞计数则常对整个大方格或数个中方格进行。

二、材料与试剂准备

进行血细胞计数板计数，需准备以下材料与试剂：

1.血细胞计数板与专用盖玻片：计数板需保持清洁，无划痕；盖玻片应具有一定厚度和平整度，以确保计数室高度准确。

2.显微镜：配备普通光学显微镜即可，最好带有微调装置和计数网格辅助功能。

3.微量移液器及配套吸头：用于精确吸取和稀释细胞悬液，通常选用量程为____μL及____μL的移液器。

4.稀释液：根据待计数细胞类型选择适宜的稀释液。例如，红细胞计数常用生理盐水，白细胞计数可选用白细胞稀释液（如稀乙酸）以破坏红细胞，而对于培养的细胞，则通常使用PBS或相应的细胞培养液。

5.试管或离心管：用于配制细胞稀释液。

6.擦镜纸、吸水纸、记号笔等。

三、操作步骤

（一）样本准备与稀释

1.细胞悬液制备：对于血液样本，需轻轻混匀；对于培养细胞，需将贴壁细胞用胰酶等消化后，吹打制成单细胞悬液，并确保细胞充分分散，避免成团。

2.稀释：根据细胞浓度预估，选择合适的稀释倍数。若细胞浓度过高，直接计数会因细胞重叠难以准确计数；浓度过低则会导致计数误差增大。稀释时，通常在试管中先加入一定量的稀释液，再加入相应体积的细胞悬液，充分混匀。例如，取10μL细胞悬液加入到90μL稀释液中，即获得10倍稀释。对于高浓度样本，可能需要进行多级稀释。

（二）计数板准备与加样

1.清洁计数板与盖玻片：用擦镜纸蘸少量75%乙醇擦拭计数板的计数室表面及盖玻片，晾干或用洁净吸水纸吸干。

2.加盖盖玻片：将专用盖玻片紧密覆盖在计数板的两个计数室上。正确的做法是将盖玻片一侧边缘与计数室边缘接触，然后轻轻放下，使盖玻片自然吸附，避免产生气泡，并确保其与计数板平台紧密贴合，形成规范的计数空间。

3.加样：用微量移液器吸取充分混匀的稀释后细胞悬液，小心地将移液器吸头尖端接触到盖玻片边缘与计数板之间的缝隙处，缓慢释放液体，利用毛细作用使细胞悬液自然流入计数室。加样量以刚好充满计数室为宜，避免过多导致液体溢出污染计数板侧面，或过少导致计数室未充满。每个计数室通常加样一次，若样本充足，可同时对两个计数室进行加样，以进行平行计数。加样后，静置1-2分钟，待细胞充分沉降且不再移动后再进行计数，避免细胞流动造成计数偏差。

（三）显微镜计数

1.放置计数板：将加样后的计数板平稳放置于显微镜载物台上，用压片夹固定。

2.观察与聚焦：先使用低倍镜（10×物镜）观察，找到计数室区域。此时可见清晰的网格线和悬浮的细胞。然后转换至高倍镜（40×物镜）进行精确计数。注意调节光线亮度，使细胞与背景对比清晰，便于区分细胞和杂质。

3.选择计数区域与计数：根据细胞密度和计数板类型选择合适的计数区域。例如，对于红细胞计数，通常选择中央大方格内四角和中央的5个中方格（共80个小格）进行计数。计数时，应遵循“数上不数下，数左不数右”的原则，即对于压在网格线上的细胞，只计数位于上线和左线的细胞，下线和右线的细胞不计数，以避免重复或遗漏。对于明显的细胞团块，若无法分散成单个细胞，则不应计入，或在报告中注明。计数过程中，同时观察细胞的形态，若发现大量异常形态细胞，也应记录。

（四）计数板清洁与整理

计数完成后，立即用流水冲洗计数板，并用软毛刷轻轻刷洗计数室（注意避免损伤计数室刻线），然后用擦镜纸擦干或晾干后妥善存放。

四、计算方法

细胞浓度（细胞数/mL）=（5个中方格内的细胞总数/5）×25（或16）×10×稀释倍数×