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探寻弓形虫新基因wx2与wx：从筛选鉴定到疫苗潜力挖掘

一、引言

1.1研究背景

弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫，其生活史复杂，涉及多种宿主和组织器官，能引起人兽共患的弓形虫病（Toxoplasmosis）。这种疾病在全球范围内广泛传播，严重威胁着人类健康和畜牧业发展。据统计，全球约有三分之一的人口感染弓形虫，在一些特定地区和人群中，感染率甚至更高。

弓形虫病对人体健康危害极大。孕妇感染弓形虫后，可通过胎盘将病原体传播给胎儿，导致流产、早产、畸胎、死胎等严重后果，即使胎儿幸存，也可能出现先天性弓形虫病，如小儿智力障碍、视力损害等，对人口素质和优生优育产生严重影响。在免疫功能低下的人群中，如艾滋病患者、器官移植受者，弓形虫感染可引发严重的弓形虫脑炎，成为导致死亡的主要原因之一。此外，弓形虫感染还与某些精神疾病的发病相关，进一步凸显了其对人类健康的潜在威胁。

在畜牧业方面，弓形虫感染可导致家畜的流产、死胎、生长发育迟缓等问题，给养殖业带来巨大的经济损失。例如，在羊、猪等养殖产业中，弓形虫病的爆发可造成大量幼畜死亡，降低养殖效益。

目前，弓形虫病的诊断、治疗和预防仍面临诸多挑战。治疗方面，现有的化学药物存在治疗周期长、药物毒副作用大、不能根治等缺陷，且尚无药物能够有效杀灭包囊内的虫体，加之弓形虫的重复感染十分迅速，使得弓形虫病难以得到有效控制。因此，研制安全高效的弓形虫病疫苗成为防治该疾病的关键。然而，弓形虫病疫苗候选分子的筛选一直是研究的瓶颈，寻找新的具有潜在疫苗价值的基因迫在眉睫。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过制备具有保护性的单克隆抗体，筛选、鉴定弓形虫病疫苗的新的候选基因，并对其进行深入研究，为弓形虫病的防治提供新的策略和方法。具体研究目的包括：

应用杂交瘤技术获得抗弓形虫的单克隆抗体，通过体内外实验观察其保护性效果，以该单克隆抗体作为探针免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库，获得对应的基因序列，从而筛选、鉴定出弓形虫病疫苗的新的候选基因。

构建该基因的核酸疫苗，观察其在动物模型中的保护效果以及对宿主机体免疫系统的影响，评估其作为疫苗的潜在价值。

应用RNA干扰技术，使获得的候选基因在转录后水平沉默，降低或缺失其表达的蛋白，进一步阐明该基因的功能和作用机制，为基因的应用前景提供理论依据，并期望获得弓形虫的减毒株，用于制备减毒活疫苗。

本研究具有重要的理论和实际意义。在理论方面，筛选和鉴定新的弓形虫疫苗候选基因，有助于深入了解弓形虫的致病机制和免疫逃逸机制，丰富对弓形虫生物学特性的认识。在实际应用方面，为开发安全、高效的弓形虫病疫苗奠定基础，有望为人类和动物弓形虫病的防治提供新的有效手段，降低弓形虫病对人类健康和畜牧业的危害，具有显著的社会效益和经济效益。

1.3研究方法与技术路线

本研究综合运用多种实验技术和方法，以实现对弓形虫新基因的筛选、鉴定及疫苗研究，具体如下：

杂交瘤技术制备单克隆抗体：利用杂交瘤技术，将免疫后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经过筛选和克隆化培养，获得能稳定分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过体内外实验，如小鼠保护实验、细胞感染实验等，观察单克隆抗体对弓形虫感染的保护性效果。

免疫筛选cDNA文库：以获得的抗弓形虫单克隆抗体作为探针，免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库。通过抗原-抗体特异性结合，筛选出阳性克隆，提取其质粒DNA，进行PCR扩增和测序，获得对应的基因序列。

基因序列分析：运用生物信息学工具，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool），对测序获得的基因序列进行同源性比较，分析其与已知基因的相似性和差异性。登录GenBank数据库，获得新基因的登录序列号，确定其为新的基因。

双色免疫荧光抗体定位和真核细胞内表达分析：采用双色免疫荧光抗体技术，对新基因编码的蛋白进行细胞内定位分析，明确其在细胞中的分布情况。构建真核表达载体，将新基因导入真核细胞中进行表达，通过Westernblot、免疫荧光等方法，检测其表达情况和免疫原性。

核酸疫苗构建与动物实验：根据新基因序列，设计并构建核酸疫苗表达载体。将核酸疫苗通过肌肉注射等方式免疫动物，如小鼠、大鼠等。定期采集动物血清和组织样本，检测血清中特异性抗体水平、细胞免疫指标等，观察疫苗对动物的保护效果，评估疫苗的免疫原性和安全性。

RNA干扰技术研究基因功能：设计针对新基因的RNA干扰序列，构建RNA干扰载体。将干扰载体导入弓形虫速殖子中，利用RNA干扰技术使新基因在转录后水平沉默。通过观察弓形虫速殖子的生长、增殖、侵袭能力等生物学特性的变化，以及对宿主细胞的影响，进一步阐明该基因的功能和作用机制。