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高效液相色谱（HPLC）培训课件

第一章液相色谱的发展与概述

色谱法的起源与发展01色谱法的诞生1906年，俄国植物学家茨维特（Tswett）在研究植物色素时，首次提出了色谱法的概念。他使用碳酸钙作为吸附剂，成功分离了植物叶绿素中的不同色素组分，开创了色谱分离技术的先河。02经典液相色谱时代早期的液相色谱采用常压操作，使用大颗粒填料，分离效率低，分析时间长达数小时甚至数天。这种方法虽然能够实现分离，但在速度、灵敏度和分离效能方面都存在明显局限。HPLC的革命性突破

HPLC的定义与别称HighPressure高压液相色谱强调其高压操作特性，这是HPLC最初也是最常用的称呼HighPerformance高效液相色谱突出其卓越的分离效能和分析性能HighSpeed高速液相色谱体现其快速分析的能力和时间优势现代液相色谱的代表HPLC作为现代液相色谱技术的代表，集高压、高效、高速于一体。无论采用哪种称呼，都指向同一种革命性的分析技术。在实际应用中，这三个名称可以互换使用，但高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography）目前最为广泛接受，因为它最全面地概括了这项技术的核心优势。HPLC已成为分析化学、药物分析、环境监测、食品检测等领域不可或缺的分析工具。

HPLC的主要特点高效液相色谱技术通过一系列技术创新，实现了分析能力的质的飞跃。以下四大核心特点使HPLC成为现代分析实验室的标准配置。高压输液系统操作压力可达150~300Kg/cm2，强大的压力驱动流动相通过致密填料床，确保稳定流速和可重复的分离条件。高压系统是实现快速高效分离的基础。卓越分离效能柱效可达5000塔板/米以上，得益于小粒径填料（3~10μm）和优化的柱技术。高柱效意味着能够分离结构相似的化合物，解决复杂样品的分析难题。超高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng水平，某些专用检测器甚至能达到pg级别。高灵敏度使得痕量分析成为可能，满足药物杂质检测、环境污染物监测等严格要求。快速高效分析分析时间从经典色谱的数小时缩短至数分钟至数十分钟，样品用量仅需微升至毫升级别。快速分析提高了实验室通量，降低了溶剂消耗和运行成本。

经典液相色谱与高效液相色谱对比经典液相色谱常压操作，依靠重力流动填料粒径大（150~200μm）柱效低（约100塔板/米）分析时间长（数小时至数天）灵敏度较低，样品用量大分离效果有限，重现性差高效液相色谱高压驱动（150~300Kg/cm2）填料粒径小（3~10μm）柱效高（5000塔板/米以上）分析快速（数分钟至数十分钟）高灵敏度，微量样品即可优异分离能力，重现性好技术的进步使HPLC在速度、效率、灵敏度等各方面全面超越经典液相色谱，成为现代分析实验室的首选工具。

第二章HPLC的基本原理理解色谱分离的本质，掌握各种分离模式的特点与应用。本章将深入探讨HPLC的分离机制、不同色谱模式的原理，以及如何根据样品性质选择合适的分离方法。

色谱分离的基本原理色谱分离的核心在于组分在固定相与流动相之间的分配差异。当样品混合物随流动相通过色谱柱时，不同组分与固定相的相互作用强度不同，导致它们以不同速度移动，最终实现分离。相互作用力吸附、分配、离子交换、排阻、亲和等多种作用力共同作用，决定组分的保留行为分配平衡组分在两相间不断进行分配平衡，分配系数的差异是分离的基础保留时间与固定相作用强的组分移动慢、保留时间长；作用弱的组分移动快、先被洗脱分离的选择性取决于固定相的性质、流动相的组成以及操作条件的优化。通过调整这些参数，可以实现对目标化合物的精确分离和定量分析。

HPLC的五大分离模式根据固定相性质和分离机制的不同，HPLC主要分为五种分离模式。每种模式适用于不同性质的化合物，理解它们的特点是方法开发的关键。液固吸附色谱利用固体吸附剂（如硅胶、氧化铝）对组分的吸附差异实现分离。适用于非极性至中等极性化合物的分离，常用于异构体和结构相似物的分析。液液分配色谱组分在两种互不相溶的液相间分配。分为正相色谱（极性固定相+非极性流动相）和反相色谱（非极性固定相+极性流动相）。反相色谱占HPLC应用的80%以上。离子交换色谱利用离子交换树脂与样品离子间的静电作用实现分离。适用于无机离子、氨基酸、蛋白质等带电荷化合物的分析，特别适合生物大分子的分离纯化。离子对色谱通过在流动相中加入离子对试剂，使离子化合物形成中性离子对，在反相柱上分离。是分析离子化合物的重要补充方法，操作简便灵活。分子排阻色谱也称凝胶渗透色谱或体积排阻色谱，根据分子大小差异分离。大分子先流出，小分子后流出。主要用于聚合物、蛋白质、多糖等大分子的分离和相对分子质量测定。

正相色谱与反相色谱比较正相色谱固定相：极性较强（硅胶、氰基、氨基等）流动相：非极性有机溶剂（正