高灵敏度检测黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA方法的建立与多维度评价.docxVIP

高灵敏度检测黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA方法的建立与多维度评价

一、引言

1.1研究背景

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是由黄曲霉（Aspergillusflavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）等真菌产生的一组具有二氢呋喃氧杂萘邻酮基本结构的次级代谢产物，种类繁多，目前已分离鉴定出12种以上，常见的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等。其中，黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），是已知化学物质中致癌性最强的一种，对包括人类在内的多种动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要体现在对肝脏的损害。

AFB1具有极高的化学稳定性，常规的工业加工或烹饪手段难以将其破坏。它在自然界中分布广泛，土壤、动植物以及各种坚果，特别是花生和核桃中都可能存在，在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也时常被检测到。一般来说，热带和亚热带等南方高温、高湿地区的食品受AFB1污染的情况最为严重，检出率也相对较高。在食品的种植、收获、储藏、运输、加工等各个环节，都有可能发生AFB1污染，这使得其难以被彻底阻止进入食物链，从而对人类健康构成严重威胁。

人类大量摄入AFB1时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生等症状；微量持续摄入，则会造成慢性中毒，导致生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生，还具有很强的致癌性，与人类肝癌和食道癌的发生密切相关。动物摄入受AFB1污染的饲料后，也会出现一系列不良反应，如家禽采食量、体增重和饲料转化率降低，不孕、流产，肺水肿，疫病易感性增加；猪会出现类似家禽的症状，还可能出现神经系统紊乱、痉挛和缺乏协调性等情况；奶牛除了采食量、产奶量、体增重和饲料转化率降低，繁殖性能紊乱，胚胎死亡和流产外，也会出现神经系统紊乱等症状。

鉴于AFB1的严重危害，许多国家和地区都制定了严格的限量标准，对食品和饲料中的AFB1含量进行管控。例如，欧盟规定食品中AFB1的最高限量为2μg/kg，我国也对各类食品中AFB1的限量做出了明确规定，如玉米、花生及其制品中AFB1的限量为20μg/kg。因此，开发快速、灵敏、准确测定黄曲霉毒素B1的方法对于保障食品安全、维护公众健康具有至关重要的意义。传统的AFB1检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）等精密仪器方法。这些方法虽然能够提供准确的检测结果，但存在设备昂贵、时间成本高、需要专业技术人员操作等缺点，难以满足现场快速检测和大量样品筛查的需求。酶联免疫吸附法（ELISA）作为一种免疫分析技术，具有操作简便、快速、灵敏度较高、可同时检测多个样品等优点，在AFB1检测中得到了较为广泛的应用。其中，间接竞争ELISA由于其独特的原理和优势，成为了研究和应用的热点之一。但该方法也存在特异性抗体制备困难导致假阴性率较高，检测结果受样品质量、操作技能等多种因素影响，测定结果的可重复性和准确性有待提高等问题。因此，进一步优化和完善检测黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA方法，提高其检测性能具有重要的研究价值和实际应用意义。

1.2间接竞争ELISA技术概述

间接竞争ELISA是一种基于抗原抗体特异性结合反应的免疫分析技术，其原理基于竞争结合和间接标记的机制。在该方法中，首先将抗原固定在固相载体表面，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质后，加入含有待检抗原的样品和特异性抗体，待检抗原和固相抗原会竞争结合有限量的特异性抗体。当样品中待检抗原含量较高时，与特异性抗体结合的机会就更多，从而使得与固相抗原结合的特异性抗体减少；反之，当样品中待检抗原含量较低时，与固相抗原结合的特异性抗体就会相对较多。经过充分反应和洗涤后，加入酶标二抗，酶标二抗会与结合在固相抗原上的特异性抗体结合，从而间接标记上酶。最后加入底物，酶催化底物发生显色反应，通过检测显色的深浅来确定样品中待检抗原的含量。颜色越深，表明结合在固相抗原上的特异性抗体越多，也就意味着样品中待检抗原的含量越低；反之，颜色越浅，则样品中待检抗原的含量越高。

相较于其他ELISA方法，间接竞争ELISA具有独特的优势。在信号放大方面，由于使用了酶标二抗，一个一抗分子可以结合多个二抗分子，每个二抗分子又带有酶标记，这种级联放大效应显著提高了检测的灵敏度，使其能够检测出极低含量的目标抗原。灵活性也是其一大亮点，同一酶标二抗可以与多种不同的一抗搭配使用，只需更换相应的一抗，就能用于检测不同的抗原