DB2308_T 182-2023 稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范.docxVIP

ICS65.020.20B05

DB23

黑龙江省佳木斯市地方标准

DB2308/T182—2023

稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范

2023-12-11发布2024-01-11实施

佳木斯市市场监督管理局发布

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DB2308/T182—2023

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由黑龙江省佳木斯市农业农村局提出并归口。

本文件由黑龙江省佳木斯市市场监督管理局批准发布。

本文件起草单位：黑龙江省农业科学院水稻研究所。

本文件主要起草人：陆文静、周通、王桂玲、周雪松、韩笑。

本文件2023年首次发布。

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稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范

1范围

本文件规定了稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）无毒基因检测PCR法技术规范。包括分子检测原理、仪器设备、试剂及样品、防污染措施、实验步骤及结果分析。

本文件适用于黑龙江省佳木斯地区水稻稻瘟病菌无毒基因AVR-Pii、AVR-Pik、AVR-Pita、AVR-Piz-t、AVR-Pia、AVR-Co39的PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3术语和缩略语

下列术语和缩略语适用于本标准。

3.1正向引物：

处于DNA双链上游的引物，简称F引物。

3.2反向引物：

处于DNA双链下游的引物，简称R引物。

3.3DNA：

Deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。

3.4PCR：

PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应

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3.5Goldenview：

核酸染料，替代溴化乙锭。

3.6DNAMarker：

标准分子量的核酸标记。

4原理

提取稻瘟病菌菌丝DNA，根据无毒基因保守区域序列设计特异性引物，对样品进行PCR扩增，根据序列比对结果，依据是否扩增得到预期的DNA片段大小的序列来判断样品是否携带该无毒基因。

5仪器设备

电子天平、瓷质研钵、研杵、移液枪、水浴锅、高速离心机、核酸浓度测定仪（NanoDrop2000）、基因扩增仪、琼脂糖电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统，其它相关仪器设备。

6试剂及样品

干燥的稻瘟病菌丝0.05g～0.1g、10%CTAB、5MNaCl、0.5MEDTA（pH8.0）、1MTris（pH8.0）、1×TE缓冲液、氯仿：异戊醇（24：1）、75%乙醇、Goldenview等。

除非另有说明，仅使用分析纯试剂和ddH2O或符合GB/T6682规定的一级水。

7实验过程防污染措施

检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。

8实验步骤

8.1稻瘟病菌菌丝DNA提取

取单孢培养后烘干的菌丝0.1g于研钵中加入液氮用研杵研磨，菌粉转入2mL灭菌离心管，并加入65℃预热的DNA提取缓冲液700μL，盖盖混匀，置于水浴锅内65℃温浴1h（期间间隔15min摇动混匀，使DNA提取缓冲液与菌丝充分混合，保证菌丝DNA的提取效率）。12000r/min离心10min，取上清液600μL置于新的2mL离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24﹕1）振荡抽提5min~10min，12000r/min离心10min。缓慢吸取上清液500μL置于新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24﹕1）振荡抽提5min～10min，12000r/min离心10min。缓慢吸取上清液300μL于新的1.5mL离心管，加入900μL、-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置10min，12000r/min离心10min。

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