分子生物学的基本操作.pptVIP

第一章分子生物学的基本操作;分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的最主要原因——

现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。;基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。;1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验;2.50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；;DescriptionofthestructureofDNA;ConservativeModel;知识回顾——核酸的化学组成;碱

基;核苷;磷酸;核苷酸的连接方式;两大技术保证：;限制酶的发现——细菌的限制与修饰现象;重组DNA实验中常见的主要工具酶;1972-PaulBerg,;分子克隆的载体----具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。;从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。;表明：????????????;;???所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。

提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。;4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复。;Generalprocessofgeneengineering;5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。;1.3基因扩增;;PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC);PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences;PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated;Endofthe1stPCRCycle–

Resultsintwocopiesoftargetsequence;TargetAmplification;PCR仪;1.4核酸的凝胶电泳;基本原理;在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。

在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。;琼脂糖凝胶电泳;称样;取样;;结果;检测:溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr）染色，紫外观察。;聚丙烯酰胺凝胶电泳;凝胶类型及浓度

;1.5基因工程载体;1.5.1质粒DNA及其分离;E．coli的质粒种类

1)colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。

2)R因子（抗药性因子）

可接合转移DNA，属低拷贝

严紧型，质粒较大，操作不便

3)F因子（性因子）;质粒载体DNA的分离——碱裂解法;1.5.2重要的大肠杆菌质粒载体;1.5.2.2.??ColE1质粒载体;1.5.2.3?pBR322质粒载体;第一个优点：分子量较小，易于纯化，操作便利。

第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。质粒DNA编码的抗生素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。

第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。;;思考题;1.5.2.4??pUC质粒载体;???第一，更小的分子量和更高的拷贝数。

???第二，可用组织化学方法检测重组体。

pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。