新型冠状病毒2022-nCoV核酸检测标准操作规程.docxVIP

新型冠状病毒202*-nCoV核酸检测标准操作指导书

1.操作步骤

1.1.试剂准备区进行

1.1.1.取出-20°C保存的试剂盒，并将试剂盒批号、过期日期等信息记录在《PCR检测记录表》上,从试剂盒取出202*-nCoV反应液，解冻，上下颠倒混匀后，点动离心；

1.1.2,取*个0.2mlPCR八连管(*二样本数目，包括质控品数量)放在PCR管架上。

1.1.3.将PCR反应液分装至八连管中,每管分装20Hl(17ulNC(0RFlab/N)反应液A和3ulNC(0RFlab/N)反应液B),盖好所有的PCR管盖，通过传递窗传送至标本制备区进行加样。

1.1.4.剩余部分要在试剂盒上标记：开启人、开启日期和剩余人份。

1.2.新冠病毒RNA的提取

1.2.1.新冠病毒RNA的提取

1.2.1.1将室温放置96孔试剂板颠倒3次，去除塑封膜后在96孔板离心机中短

暂离心(或手甩)，避免挂液。撕去96孔试剂板上的铝箔膜，确认板子方向(磁

珠在第6/12列)。

1.2.1.2在96孔板的第1及第7列孔中加入200叱样品，避免交叉污染。

1.2.1.3将96孔板放入Smart32核酸提取仪中，装上磁棒护套。

1.2.1.4按以下程序进行自动化提取实验：

1.2.1.5自动化程序结束后，将第6及第12列的洗脱液转移至干净的无核酸酶

离心管中；如不马上使用，请将洗脱液转移至新的1.5m1.无核酸酶离心管中，零下20度保存。

1.3.PCR扩增

1.3.1.在样本制备区的生物安全柜中进行加样操作，并使用干净的手套进行实验操作。

1.3.2.取出提取的RNA保存离心管,摆放在1.5ml离心管架上，若经过冷冻处理，则需进行解冻，振荡混匀后进行点动离心。

1.3.3.根据RNA上的编号对准备好的PCR混合液进行编号。

1.3.4.打开PCR管盖，分别用干净的滤芯枪头加入5u1.对应编号的样本RNA至PCR混合液中。每一次实验需要同时扩增三个阴性质控（1份生理盐水，2份阴性样本）和1个弱阳质控。

1.3.5.加完模板的枪头应小心打入废液缸中，并确保移液器前臂没有碰到废液缸□o

1.3.6.加完所有模板后，仔细核对加样顺序与编号是否正确，确保每个反应管的加样无误。

1.3.7.确定每个八连管的盖子盖紧后，在微型离心机上进行点动离心去气泡（或在扩增区微型离心机上进行），并通过传递窗传送至扩增区进行扩增。

1.3.8.以达安AGS4800定量PCR操作为例：打开程序软件，按样本对应顺序设置空白质控品、阴性质控品、阳性质控品以及未知样本；探针检测模式设置为：Reporter1：FAM,Quencher1：NONE；Reporter2：VIC,Quencher2：NONE；Reporters：Cy5,Quencher3：NONE

1.3.9.将八连管放入PCR仪中，整体按压管盖使其压紧，在《48孔板工作表》记录每个样本在PCR仪上的位置,确认程序正确并已启动后，实验人员方可离开,进行PCR反应。

2.室内质控

2.1.质控品来源

名称

来源

有留样检测、生理盐水及阳性对照参与提取-扩增的全过程，全程操作同标本的处理。只有连续评价结果在控，本实验室测定工作可靠，检验报告才可发出。

2.3.失控判断规则

阴性质控品：FAM和(或)VIC检测通道有明显扩增曲线；Cy5通道无明显扩增曲线；

阳性质控品：FAM和VIC检测通道任意一个或两个通道无明显扩增曲线；Ct值＞32,Cy5通道有或无扩增曲线;

空白质控品：任意一个通道或所有通道有明显扩增曲线；以上规则任意一个满足均为失控，需重新进行试验。

2.4.失控处理

分析并填写《失控分析报告》

3.结果解释

3.1.结果判读

10.1.1.如果检测样品在FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值＞40,且Cy5通道有扩增曲线，可判样品未检测到202*新型冠状病毒(202*-nCoV)RNA；

10.?1.2.如果检测样品在FAM和VIC通道Ct值W40,且有明显的扩增曲线，可判样品为202*新型冠状病毒(202*-nCoV)阳性。

10.1.3.如果检测样品仅在FAM或VIC单一通道Ct值W40,另一通道无扩增曲线,结果需复检，复检结果仍为单通道阳性(阳性通道与之前一致或不一致)可判样品为202*新型冠状病毒(202*-nCoV)阳性；复检均为阴性可判断为未检测到202*新型冠状病毒(202*-nCoV)RNA。