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基因工程的重组连接

——DNA连接酶

DNA连接酶概念：DNA连接酶存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3’羟基和5’磷酸基团共价形成3’-5’磷酸二酯键，使断开的DNA切口连接起来，因此它在DNA复制、修复以及体内体外的重组过程中起重要作用。分类：E.coliDNAligase:需要烟酰胺腺嘌呤（NAD+）作辅助因子，NAD++酶?酶-AMP，同时释放出烟酰胺单核苷酸（MMN）?活化的酶复合物在DNA切口处修复磷酸二酯键，并释放AMP。T4DNAligase：由T4噬菌体基因编码，分子量约为60KDa。其活性以ATP为辅助因子，它与酶形成复合物，并释放磷酸焦磷酸基团。

DNA连接酶

DNA连接酶DNA连接反应的影响因素1.酶活单位：1国际单位（U）的T4-DNAligase的定义为：在最佳缓冲系统及15℃，1h内完全连接1μgλ-DNA的HindⅢ片断所需的酶量。2.T4-DNAligase的缓冲条件：50~100mmol/LTris-HCl(pH7.5)10mmol/LMgCl25mmol/LDTT?1mmol/LATP一般连接反应的总体系控制在10-15ul内。同样T4DNA连接酶储藏于50%的甘油中，而过高的甘油浓度对酶活也有抑制。因此酶的总用量也不要超过总体系的1/10。

DNA连接酶影响T4DNA连接酶连接反应的因素：温度：大多数限制性内切酶产生的粘性片段的Tm为15℃，另一方面T4DNA连接酶本身最合适的反应温度为37℃，5℃以下活性大大下降。因此在实际操作中，我们多采用过夜15℃-16℃连接；离子浓度：过高或过低的离子浓度会影响反应速度；DNA片段：DNA末端的性质如果为粘性末端可以看作分子内的连接反应；但如果为平头DNA分子之间连接，则是分子间连接，速度大大下降；DNA浓度、DNA片段的大小分子内连接：片段与载体的摩尔数比=2：1—3：1分子间连接：51.1/(DNA浓度：g/L)?(分子量：dalton)的值如果小于1则容易发生分子间的连接反应一般性规律是：DNA浓度越稀越容易发生分子内连接反应。

DNA连接酶普通连接反应的设计：总体系10ul10×buffer1ulVector(3k;500ng/ul)1ulDNAfragment(500bp;50ng/ul)3-5ulLigase0.5-1ulH2O加水至10ul

DNA连接酶在连接前用碱性磷酸单酯酶处理载体DNA，去除其5’端的磷酸基团，这样即使DNA载体分子的两个粘性末端发生退火，也不能形成自身共价环化结构；在连接反应之前，用末端脱氧核苷酰转移酶（TdT)在载体分子的3’羟基末端聚合一段同种碱基的寡核苷酸，防止载体分子之间以及两个末端自连，而在外源DNA片段的3’端加上与之互补的寡核苷酸，二者退火后再连接。

DNA连接酶DNA分子重组的方法：相同的粘性末端的连接：如果外源DNA分子与DNA载体均使用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶切还是双酶酶切，两种分子均具有相同的粘性末端，因此混合后它们可以顺利连接成为一个重组分子。相同的双酶酶切：定向克隆单酶酶切：重组分子有两种情况，即正方向插入和反方向插入。但无论如何，用原有的限制性酶切酶可以将外源片段DNA和载体DNA切开（如何鉴定片段为正向或者反向插入）；用两种同尾酶分别切割DNA片段和载体DNA（如DNA建库中，Sau3AI酶切外源DNA，而?-phage载体用BamHI处理），其实产生了4个相同的粘性末端，因此分子之间可以直接连接，但连接后大多数情况下是用原有的两种同尾酶无法将片段和载体切开，这种酶切口称为“焊死”作用。当然少数情况下产生的连接重组分子可以被一种酶切开（如可以被Sau3A切开）。

DNA连接酶

DNA连接酶平头末端的连接：T4DNA连接酶既可以连接粘性末端，也能DNA平头末端的连接。前者属于分子内反应，后者属于分子间反应，因此从分子动力学角度来讲，后者反应复杂得多，也慢得多，一般只有前者速度的1/10-1/100。因此，如何提高平头连接速度，包