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黑曲霉中天门冬酰胺酶基因同源表达的研究与应用探索

一、引言

1.1研究背景

天门冬酰胺酶（Asparaginase，EC3.5.1.1）作为一种具有重要应用价值的酶，在多个领域发挥着关键作用。在医药领域，它是治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）的一线药物。ALL患者的癌细胞缺乏天冬酰胺合成酶，无法自身合成天冬酰胺，而天门冬酰胺酶能够催化天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，切断癌细胞的天冬酰胺供应，从而抑制癌细胞的蛋白质合成，达到抑制癌细胞生长和增殖的目的。除了ALL，天门冬酰胺酶对急性粒细胞性白血病、急性单核细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等也有一定疗效。

在食品工业中，天门冬酰胺酶同样具有重要作用。在高温加工淀粉类食品时，天冬酰胺与还原糖会发生美拉德反应，产生致癌物丙烯酰胺。天门冬酰胺酶可以通过催化天冬酰胺水解，阻断这一反应，从而有效降低食品中丙烯酰胺的含量，提高食品的安全性。在饼干、薯片、烤面包等烘烤或煎炸食品的生产中，添加适量的天门冬酰胺酶能够显著减少丙烯酰胺的生成。

目前，天门冬酰胺酶主要来源于微生物发酵，如大肠杆菌、欧文氏菌等细菌以及部分真菌。然而，现有的生产菌株存在一些问题，如酶产量低、活性不稳定、分离纯化困难等，这些问题限制了天门冬酰胺酶的大规模生产和广泛应用。黑曲霉（Aspergillusniger）作为一种重要的工业微生物，具有生长迅速、易于培养、蛋白表达和分泌能力强等优点，被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为GRAS（GenerallyRecognizedasSafe）菌株，在食品和医药领域具有良好的应用前景。因此，开展天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达研究，对于提高天门冬酰胺酶的产量和活性，降低生产成本，推动其在医药和食品等领域的应用具有重要意义。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过基因工程技术，实现天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达，构建高效表达天门冬酰胺酶的工程菌株。具体而言，从黑曲霉基因组中克隆天门冬酰胺酶基因，构建黑曲霉表达载体，并通过农杆菌介导法等转化技术将表达载体导入黑曲霉中，筛选获得稳定表达天门冬酰胺酶的重组菌株。

本研究具有重要的理论和实际意义。在理论方面，深入研究天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的表达调控机制，有助于揭示丝状真菌基因表达的分子生物学原理，丰富基因工程的理论知识。在实际应用方面，通过在黑曲霉中高效表达天门冬酰胺酶，能够提高酶的产量和活性，为医药和食品工业提供更优质、更经济的酶源。在医药领域，有助于降低白血病等疾病的治疗成本，提高治疗效果，拯救更多患者的生命；在食品工业领域，能够更有效地降低食品中丙烯酰胺的含量，保障消费者的健康，促进食品行业的可持续发展。

1.3文献综述

1.3.1天门冬酰胺酶概述

天门冬酰胺酶，系统名为L-天冬酰胺氨基水解酶，能够催化L-天冬酰胺水解生成L-天冬氨酸和氨。其化学本质为蛋白质，不同来源的天门冬酰胺酶在结构上存在一定差异，但通常都由多个亚基组成。大肠杆菌来源的天门冬酰胺酶Ⅱ由4个相同的亚基组成，每个亚基含有326个氨基酸，分子质量为141kDa，且只有四聚体才具有酶活性。

该酶的作用机制是通过与天冬酰胺分子特异性结合，利用其活性中心的氨基酸残基对天冬酰胺的酰胺键进行水解。具体过程为，天门冬酰胺酶与天冬酰胺结合形成酶-底物复合物，然后酶-底物复合物发生构象变化，使天冬酰胺的酰胺键暴露，水分子进攻酰胺键，导致酰胺键断裂，生成天冬氨酸和氨，最后产物从酶-底物复合物中释放出来，酶恢复活性。

除了在医药领域用于治疗白血病等恶性肿瘤，以及在食品工业中用于降低丙烯酰胺含量外，天门冬酰胺酶在其他领域也有应用。在生物催化领域，可用于催化天冬酰胺水解为天冬氨酸，用于合成特定氨基酸衍生物；在农业领域，有研究探索其对植物生长和抗病性的影响。

1.3.2黑曲霉作为表达宿主的优势

黑曲霉作为一种丝状真菌，在基因表达领域具有诸多显著优势，使其成为理想的表达宿主。首先，黑曲霉具有强大的蛋白表达能力。它能够高效转录和翻译外源基因，许多研究已成功利用黑曲霉表达了多种异源蛋白，如淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等，表达量较高，能满足工业生产需求。其次，黑曲霉的分泌能力强，可将表达的蛋白高效分泌到细胞外，便于后续的分离和纯化，降低生产成本。与其他一些表达系统相比，黑曲霉分泌的蛋白往往具有正确的折叠和修饰，具有较高的生物学活性。再者，黑曲霉的胞外蛋白酶活性较低，能够减少对表达蛋白的降解，提高蛋白的稳定性和产量。此外，黑曲霉生长迅速，能在多种廉价培养基上生长，培养条件简单，易于大规模发酵生产。而且，它被FDA认定为GRAS菌株，在食品和医药领域的应用安全性高，不存在潜在的安全风险。