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SPC-Cre转基因小鼠的建立

一、研究背景

基因功能研究在现代生物学和医学领域至关重要，而小鼠作为常用的模式生物，其基因编辑技术为研究特定基因在体内的功能提供了有力手段。在肺部相关研究中，肺泡上皮细胞的功能研究备受关注。SPC（surfactantproteinC，表面活性蛋白C）是肺泡II型上皮细胞特异性表达的蛋白，利用SPC基因的启动子驱动Cre重组酶表达，构建SPC-Cre转基因小鼠，可实现对肺泡II型上皮细胞中特定基因的条件性敲除或激活，有助于深入探究肺泡II型上皮细胞在肺发育、生理及疾病发生发展过程中的作用机制。目前已有多种基于Cre-loxP系统的基因敲除小鼠模型用于肺泡上皮细胞基因功能研究，但部分模型存在局限性，如早期构建的一些模型中Cre介导的重组起始于胚胎期且不受控制，不利于成年阶段相关研究。因此，构建可调控、特异性高的SPC-Cre转基因小鼠具有重要意义。

二、材料与方法

（一）实验材料

实验动物：选用C57BL/6J小鼠作为转基因小鼠构建的背景品系，该品系小鼠遗传背景清晰、繁殖性能良好且免疫反应稳定，广泛应用于基因编辑小鼠的构建。

载体构建相关材料：包含人SPC基因启动子（hspc-p）的质粒、Cre重组酶编码序列（Cre）、可被他莫昔芬诱导的雌激素受体片段（ER^{T2}）、来自SV40病毒的多聚腺苷酸序列（pa）等。限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒等分子生物学工具酶及相关试剂盒。感受态大肠杆菌DH5α用于载体的扩增。

胚胎操作相关材料：显微注射设备，包括倒置显微镜、显微操作仪、持卵管、注射针等。胚胎培养液，如M2、M16培养液。超排卵试剂，如孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）。假孕母鼠，由结扎公鼠与正常母鼠交配获得。

（二）实验方法

SPC-Cre-ER^{T2}表达载体构建

以含有hspc-p的质粒为模板，利用PCR技术扩增人SPC基因启动子片段，引物设计时引入合适的限制性内切酶酶切位点，以便后续载体构建。

将扩增得到的hspc-p片段与同样经酶切处理的含有Cre-ER^{T2}编码序列及pa序列的载体进行连接，构建成SPC-Cre-ER^{T2}表达载体。连接反应体系为：载体片段50ng，插入片段（hspc-p）100ng，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，补水至10μL，16℃连接过夜。

将连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α中，转化步骤如下：取10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟；42℃热激90秒，迅速放回冰浴2分钟；加入900μL不含抗生素的LB培养液，37℃振荡培养1小时；将菌液涂布于含有相应抗生素（根据载体抗性选择）的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

次日，挑取平板上的单菌落接种至含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定及测序验证，确保载体构建正确。

转基因小鼠制备

超排卵及受精卵采集：选取6-8周龄的雌性C57BL/6J小鼠，腹腔注射PMSG，剂量为10IU/只，48小时后腹腔注射hCG，剂量为10IU/只。注射hCG后立即将雌鼠与正常雄鼠按1:1合笼。次日清晨检查雌鼠阴道栓，有阴道栓者视为成功交配，将其颈椎脱臼处死，取出输卵管，置于M2培养液中，在显微镜下用镊子撕开输卵管壶腹部，释放出受精卵，挑选形态正常的受精卵转移至M16培养液中培养备用。

显微注射：将经鉴定正确的SPC-Cre-ER^{T2}表达载体进行大量提取及纯化，调整浓度至2-3ng/μL。利用显微注射设备，将SPC-Cre-ER^{T2}表达载体溶液注射到受精卵的雄原核中。注射时，在倒置显微镜下，用持卵管固定受精卵，注射针缓慢刺入雄原核，注入适量的载体溶液，可见原核膨大。注射后的受精卵在M16培养液中培养一段时间，观察其发育情况，选取发育正常的受精卵进行移植。

胚胎移植：将假孕母鼠（与结扎公鼠交配后0.5天）麻醉，在腹部做一小切口，暴露输卵管。用移植针将培养后的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管壶腹部，每侧输卵管移植10-15枚受精卵。缝合腹部切口，将母鼠放回饲养笼中饲养，待产仔。

转基因小鼠鉴定

PCR鉴定：仔鼠出生2-3周后，剪取鼠尾组织约0.5cm，采用酚氯仿法提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，检测是否含有SPC-Cre-ER^{T2}转基因。引物设计如下：Cre-f引物结合位点为Cre