双缩脲法测定蛋白质含量实验原理与操作.pdfVIP

实验双缩脲法测定蛋白质浓度

一、实验目的

1.学习分光光度法测定的原理和方法

2.学习蛋白质含量测定的原理和方

法

3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法

二、原理

一、分光光度法的基本原理及方法

（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析

1．原理

2．主要方法：

1比较吸收光谱曲线

2比较最大吸收波长

蛋白质的最大吸收波长为280nm，

核酸的最大吸收波长为260nm。

（3）比较吸光度的比值

A

260nm

纯DNA1.8

A

280nm

（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析

1．原理

Beer-Lambert（比尔）定律：

T=I/I0

A=lg1/T=lgI/I

0

A=KCL

其中：T为透光率；A为吸光率；I为入射

0

光强度；I为透射光强度；

K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光

程的厚度

2．常用方法

（1）标准曲线法

▪标准曲线与样品的测定条件必须一致。

2标准管法

C/A=C/A，已知C，测定A、A，可

XXSSSSX

求得C。

X

3摩尔吸光系数法

C=A/（为L=1cm，C为1mol/L时的

吸光系数，也称为摩尔吸光系数。

四、分光光度计的使用

1．722型分光光度计的外形

2.仪器操作键介绍

“方式设定”键（MODE）：用于设置测

试方式

“100%T/0ABS”键：用于自动调整

100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)

“0%T”键：用于自动调整零透射比“

波长设置”旋钮：用于设置分析波长

3.样品测试操作

①打开电源开关，使仪器预热20分钟

②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波

长位置上

③打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉

入光路

④盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零

⑤取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射

比

⑥按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式

(A)

⑦将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中

⑧打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽

中，盖上样品室盖

⑨将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A

⑩将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测

样品的吸光度参数

实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。

光路

返回

光路

返回

返回

微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量

▪被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，

氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入

强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽

蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸

溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于

被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计

算样品的含氮量。

▪因为蛋白质含氮量通常在