水貂奇异变形杆菌的分离鉴定及OMPA基因克隆与原核表达研究.docxVIP

水貂奇异变形杆菌的分离鉴定及OMPA基因克隆与原核表达研究

一、引言

1.1研究背景

水貂作为重要的毛皮动物，其养殖业在全球范围内具有重要的经济地位。随着水貂养殖规模的不断扩大和集约化程度的提高，各种疾病的发生也日益频繁，给养殖业带来了严重的经济损失。奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）是一种广泛存在于自然界中的条件致病菌，可感染多种动物，包括水貂。水貂感染奇异变形杆菌后，常引起出血性胃肠炎等消化道疾病，严重时可导致死亡，给养殖户造成巨大的经济损失。据相关研究报道，在水貂养殖过程中，奇异变形杆菌型消化道疾病的发病率呈上升趋势，且由于该菌对多种抗生素具有耐药性，治疗难度较大，进一步加重了养殖户的经济负担。因此，对水貂奇异变形杆菌进行分离鉴定，并深入研究其致病机制和防控措施，具有重要的现实意义。

1.2奇异变形杆菌概述

奇异变形杆菌属于肠杆菌科变形杆菌属，是一种需氧、能运动、有鞭毛的革兰氏阴性杆菌。其大小一般在（0.4～0.6）μm×（1.0～3.0）μm之间，两端钝圆。在固体培养基上，奇异变形杆菌会呈现出特有的迁徙生长现象，形成波纹状的菌落，这是由于细菌在营养丰富的情况下，通过分泌的多种酶分解琼脂中的多糖，释放出生长因子，促进了细菌的快速扩散。此外，奇异变形杆菌在血琼脂平板上可产生α溶血，表明其具有一定的毒力。

奇异变形杆菌的营养需求不高，可在普通的琼脂培养基上生长，但其最适生长温度为37°C，在营养丰富的培养基上生长更为旺盛。在SS琼脂平板上，奇异变形杆菌可形成圆形、扁薄的半透明菌落，而在血琼脂平板上则会形成迁徙生长的波纹状菌落。该菌能够分解尿素，这是其重要的生化特征之一，此外，它还能够发酵多种糖类，但不产生吲哚，MR试验和VP试验均为阴性，通过这些生化特性可以对奇异变形杆菌进行初步的鉴定。

奇异变形杆菌是一种条件致病菌，广泛分布于水、土壤、腐败的有机物以及人和动物的肠道中。在动物正常情况下，本菌无致病作用，动物不会发病，但当肠道功能受到扰乱，或机体抵抗力下降时，奇异变形杆菌方可致病，故本病多在应激情况下发生。该菌可引起多种感染，如慢性中耳炎、创伤感染、膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等，也是仅次于大肠埃希菌的泌尿系统感染的主要病原菌，肾结石和膀胱结石的形成可能与变形杆菌感染有关，有的菌株还可引起败血症、腹膜炎、脑膜炎等严重疾病。

1.3OMPA基因研究进展

外膜蛋白A（OutermembraneproteinA，OmpA）是革兰氏阴性菌外膜的主要组成成分之一，在细菌的生长、代谢、致病及免疫等过程中发挥着重要作用。OmpA基因编码的OmpA蛋白具有高度的保守性，其结构和功能在不同的细菌中具有一定的相似性。

OmpA蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生特异性抗体，因此在细菌感染的诊断和疫苗研发中具有重要的应用价值。研究表明，以OmpA蛋白为抗原建立的酶联免疫吸附试验（ELISA）等检测方法，可用于快速、准确地检测细菌感染，为临床诊断提供了有力的工具。此外，OmpA蛋白还可作为疫苗的候选抗原，用于制备亚单位疫苗，激发机体的免疫应答，预防细菌感染。

在水貂奇异变形杆菌的研究中，OmpA基因的研究尚处于起步阶段。目前，对于水貂奇异变形杆菌OmpA基因的克隆、表达及功能研究报道较少，深入研究水貂奇异变形杆菌OmpA基因，对于揭示其致病机制、开发新型诊断方法和防控措施具有重要的意义。

1.4研究目的与意义

本研究旨在从患病水貂体内分离鉴定奇异变形杆菌，并对其OMPA基因进行克隆与原核表达，为进一步研究水貂奇异变形杆菌的致病机制、开发快速诊断方法和新型疫苗奠定基础。

通过对水貂奇异变形杆菌的分离鉴定，明确其生物学特性和流行规律，为水貂奇异变形杆菌病的诊断和防控提供科学依据。对OMPA基因进行克隆与原核表达，获得大量的重组OmpA蛋白，为后续研究其免疫原性和抗原性提供材料，有助于开发基于OmpA蛋白的快速诊断试剂盒和亚单位疫苗，从而有效预防和控制水貂奇异变形杆菌病的发生和传播，减少养殖户的经济损失，促进水貂养殖业的健康发展。

二、材料与方法

2.1实验材料

病料采自山东省某发病水貂养殖场，选取具有典型出血性胃肠炎症状的病死水貂5只，无菌采集其肝脏、脾脏、肠道等组织，用于细菌的分离培养。

实验菌株为大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)，由本实验室保存；pMD18-T克隆载体购自TaKaRa公司；pET-32a(+)原核表达载体购自Novagen公司。

限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ，T4DNA连接酶，DNAMarker，DL2000，rTaqDNA聚合酶等均购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA