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酸性排水沉积物中微生物DNA的多种提取方法

酸性排水沉积物因其特殊的酸性环境和复杂的沉积物组成，使得其中微生物DNA的提取具有一定挑战性。以下介绍几种常用的提取方法，每种方法都有其独特的原理和适用场景。

一、化学裂解法

（一）CTAB法

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，在高盐溶液中能与核酸形成复合物，而在低盐浓度下复合物会沉淀，从而实现核酸的分离。该方法的具体操作步骤如下：

取适量酸性排水沉积物样品，加入含有CTAB提取缓冲液（通常包含CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl等）的离心管中，充分混匀。

向混合液中加入蛋白酶K，在适宜温度（如55℃）下孵育一段时间，以消化沉积物中的蛋白质等杂质。

进行水浴加热（如65℃），并伴随轻柔振荡，使微生物细胞裂解，释放出DNA。

加入氯仿-异戊醇（24:1）混合液，充分振荡后离心，去除蛋白质和其他有机杂质。

收集上清液，加入异丙醇或乙醇，使DNA沉淀。

离心得到DNA沉淀，用70%乙醇洗涤，晾干后溶于适量TE缓冲液中。

（二）SDS法

SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，能破坏细胞膜和核膜结构，使蛋白质变性，同时释放出核酸。SDS法提取微生物DNA的主要步骤包括：

将酸性排水沉积物样品与SDS提取缓冲液（含有SDS、Tris-HCl、EDTA、NaCl等）混合，充分悬浮。

加入蛋白酶K，在37℃条件下孵育，降解蛋白质。

于65℃水浴中加热，促使细胞裂解和DNA释放。

采用苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）进行抽提，去除蛋白质和其他杂质。

对上清液进行乙醇沉淀，获得DNA。

用70%乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后溶于TE缓冲液。

二、物理破碎法

（一）珠磨法

珠磨法是利用玻璃珠、陶瓷珠等研磨介质在高速振荡或搅拌下，与沉积物样品和细胞发生剧烈碰撞和摩擦，从而破碎细胞，释放出DNA。该方法的操作流程如下：

将酸性排水沉积物样品与适量的裂解缓冲液（如Tris-EDTA缓冲液）加入到含有研磨珠的裂解管中。

将裂解管放入珠磨机中，在高速（如6000rpm）下振荡一定时间（如2-5分钟）。

振荡结束后，离心收集裂解液。

对裂解液进行后续的纯化处理，如采用氯仿-异戊醇抽提、乙醇沉淀等步骤，得到纯净的DNA。

（二）冻融法

冻融法是基于细胞在反复冷冻和融化过程中，由于细胞内冰晶的形成和膨胀，导致细胞膜破裂，从而释放出DNA。具体操作如下：

将酸性排水沉积物样品与裂解缓冲液混合。

将混合液置于-20℃或-80℃冰箱中冷冻一段时间（如1-2小时）。

取出冷冻后的样品，在37℃水浴中快速融化。

重复冷冻-融化过程2-3次，以充分破碎细胞。

离心去除细胞碎片和沉积物颗粒，收集上清液。

对上清液进行纯化，获得DNA。

三、商业试剂盒法

（一）硅胶膜吸附法试剂盒

这类试剂盒的原理是利用硅胶膜在高盐条件下能特异性吸附DNA，而在低盐或水溶液中释放DNA的特性来实现DNA的提取和纯化。以某品牌土壤DNA提取试剂盒为例，操作步骤如下：

取适量酸性排水沉积物样品，加入试剂盒提供的裂解缓冲液和研磨珠，在涡旋振荡器上充分振荡，破碎细胞。

离心后收集裂解液，加入结合缓冲液，调节溶液的盐浓度和pH值，使DNA与硅胶膜结合。

将混合液转移到吸附柱中，离心，DNA吸附在硅胶膜上，杂质随废液流出。

用洗涤缓冲液洗涤吸附柱，去除残留的杂质。

最后用洗脱缓冲液（如TE缓冲液或无菌水）洗脱硅胶膜上的DNA，得到纯化的DNA溶液。

（二）磁珠法试剂盒

磁珠法试剂盒是利用磁珠表面修饰的特定官能团（如硅羟基、羧基等）在一定条件下能与DNA结合，在外加磁场的作用下，磁珠-DNA复合物可以与其他杂质分离，从而实现DNA的提取。其操作步骤大致为：

将酸性排水沉积物样品与裂解液混合，通过物理或化学方法破碎细胞，释放DNA。

加入磁珠和结合缓冲液，使DNA与磁珠结合。

利用磁场将磁珠-DNA复合物吸附在管壁上，倒掉上清液。

用洗涤液洗涤磁珠，去除杂质。

最后用洗脱液洗脱DNA，得到纯净的DNA产物。

四、改良方法

（一）联合使用化学裂解和物理破碎

由于酸性排水沉积物中可能含有较多的难破碎微生物细胞和复杂的有机质，单一的化学裂解法或物理破碎法可能提取效率不高。因此，可将化学裂解和物理破碎方法联合使用，以提高DNA的提取效率。例如，在CTAB法的基础上，加入珠磨破碎步骤，先通过化学试剂破坏细胞结构，再利用珠磨的物理作用进一步破碎细胞，释放更多的DNA。具体操作是：在加入CTAB提取缓冲液和蛋白酶K孵育后，进行珠磨破