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地克珠利对柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶特性的影响：机制与应用探究

一、引言

1.1研究背景与意义

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种肠道寄生原虫病，对养鸡业危害极大。全球范围内，每年因鸡球虫病造成的经济损失高达10多亿美元，其中抗球虫药的年消费就达3.2亿美元。鸡球虫共有7个种，致病性各有不同，其中柔嫩艾美耳球虫的致病性最强，可引发鸡急性盲肠球虫病，严重时导致鸡只死亡。当前，药物防治仍是控制球虫病的主要手段，然而球虫生命周期短、繁殖速度快，在长期药物压力下极易产生耐药性，使得许多传统抗球虫药物的疗效逐渐降低。

地克珠利作为一种三嗪类化合物，自1986年由比利时杨森制药厂研制以来，因其高效、低毒、广谱的抗球虫效力，在鸡球虫病的防治中发挥了重要作用，受到广大养殖户的欢迎。但长期使用或使用不当，球虫对其耐药性问题日益凸显。为了防止或延缓耐药性的发生，以及研制新的有效药物，深入了解地克珠利抗寄生虫的分子作用机制，确定其靶标分子迫在眉睫。

乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDH）在寄生虫的生理活动中扮演着关键角色。它是糖酵解途径的末端酶，能催化丙酮酸与乳酸之间可逆的氧化还原反应。大多数体内寄生虫依赖糖酵解途径将葡萄糖代谢为乳酸来获取能量，以维持生存与繁殖。已有研究表明，柔嫩艾美耳球虫地克珠利敏感株LDH（sEtLDH）与耐药株LDH（rEtLDH）的同工酶谱存在显著差异，这暗示着EtLDH与地克珠利抗球虫作用机理存在紧密联系。因此，研究地克珠利对柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶特性的影响，对于揭示地克珠利的抗球虫分子作用机制、寻找潜在的药物靶标具有重要的理论意义，也为开发新型抗球虫药物、优化球虫病防治策略提供关键的科学依据，具有重大的实践应用价值。

1.2国内外研究现状

国外对于地克珠利抗球虫的研究起步较早，在其药理作用、临床应用等方面取得了一定成果。研究明确了地克珠利对感染鸡的6种重要艾美耳球虫，包括堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、布什艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和缓艾美耳球虫均有效果，其作用峰期主要在子孢子和第一代裂殖体的早期阶段，对巨型艾美耳球虫作用于合子阶段，对布氏艾美耳球虫小配子阶段有高效，且对形成孢子化卵囊也有抑制作用。但在分子机制研究方面，虽然认识到地克珠利可能影响球虫核酸合成，阻止裂殖体和小配子体进一步分化，使裂殖生殖和配子生殖不能正常进行，但具体的分子靶点和作用通路尚未完全明确。

在国内，地克珠利于1995年合成，1997年获国家二类新兽药证书并推广。大量研究集中在其对鸡球虫病的防治效果上，证实了地克珠利混悬液、纳米乳等不同剂型在预防和治疗鸡球虫病方面具有良好效果，且具有使用浓度低、安全范围大等优点。在抗球虫作用机制研究方面，虽有一些从细胞和亚细胞水平的探讨，但有关分子机理的研究仍较少，尤其是地克珠利与球虫体内关键酶如乳酸脱氢酶之间的相互作用研究还不够深入。

关于乳酸脱氢酶在寄生虫生理活动中的作用，国内外研究均表明，LDH作为糖酵解途径的关键酶，与寄生虫的生存、繁殖密切相关，是良好的诊断分子和潜在的药物作用靶标。对疟原虫、弓形虫等原虫的LDH研究相对较多，在分子生物学和免疫学方面取得了一定成果，证实了其在疾病诊断和药物研发中的重要价值。然而，对于鸡球虫尤其是柔嫩艾美耳球虫的LDH研究相对较少，在其基因结构、蛋白特性以及与抗球虫药物相互作用机制等方面还有待进一步深入探索。

1.3研究目标与内容

本研究旨在深入探究地克珠利对柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶特性的影响，具体研究内容如下：

柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶（EtLDH）单克隆抗体的制备及其在蛋白定位中的应用：利用大肠杆菌表达的重组EtLDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术制备单克隆抗体，并对其相关特性进行测定。运用免疫荧光等技术，确定EtLDH在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的分布，为后续研究提供基础。

柔嫩艾美耳球虫地克珠利敏感株与耐药株乳酸脱氢酶特性的差异研究：收集并纯化地克珠利敏感株与耐药株柔嫩艾美耳球虫四个阶段（子孢子、第一代裂殖子、第二代裂殖子、配子体）的虫体，提取总RNA，构建pGEM-Teasy-rEtLDH重组克隆质粒。分析敏感株与耐药株LDH的CDS及编码蛋白差异，以及在不同发育阶段的转录水平、蛋白翻译水平和酶活水平的差异，从多层面揭示两者特性差异。

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫孢子生殖过程乳酸脱氢酶的影响研究：收集并纯化未孢子化卵囊，用不同浓度地克珠利进行处理，观察药物对孢子化率的影响。同时，检测药物处理后EtLDH的酶活性、转录水平和翻译水平的变化，探讨地克珠利对孢子生殖过程中LDH的作用机制。

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫裂殖生殖过程