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人去乙酰化酶SIRT1的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

一、研究背景与意义

去乙酰化酶SIRT1是一种依赖于NAD+的去乙酰化酶，在细胞的多种生理过程中发挥着至关重要的作用。它参与了细胞衰老、能量代谢、应激反应等多种生物学过程的调控，与多种疾病的发生发展密切相关，如癌症、神经退行性疾病、代谢综合征等。

对人去乙酰化酶SIRT1进行基因克隆及在大肠杆菌中的表达研究，具有重要的理论和实际意义。从理论上讲，这有助于深入了解SIRT1的结构与功能之间的关系，探索其在各种生理和病理过程中的作用机制。从实际应用来看，获得大量的重组SIRT1蛋白可以为相关疾病的诊断、治疗以及药物筛选提供重要的物质基础。

二、基因克隆

（一）材料与试剂

模板：含有人类SIRT1基因的cDNA文库。

引物：根据GenBank中公布的人SIRT1基因序列设计特异性引物，上游引物引入限制性内切酶位点（如BamHⅠ），下游引物引入另一种限制性内切酶位点（如HindⅢ），以便后续的载体连接。

酶类：TaqDNA聚合酶、限制性内切酶（BamHⅠ和HindⅢ）、T4DNA连接酶等。

载体：pET-28a(+)质粒，该载体含有His标签，便于重组蛋白的纯化。

其他试剂：dNTPs、DNA分子量标准、琼脂糖、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等。

（二）方法

PCR扩增目的基因

反应体系：按照一定比例混合cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶及相应的缓冲液。

反应条件：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。

扩增产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小和纯度，使用胶回收试剂盒回收目的片段。

目的基因与载体的酶切

分别对回收的SIRT1目的基因和pET-28a(+)质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切。

酶切体系：按照酶的说明书配置，包含目的基因或质粒、两种限制性内切酶、相应的缓冲液，37℃水浴反应数小时。

酶切产物回收：使用胶回收试剂盒回收酶切后的目的基因和载体片段。

连接反应

用T4DNA连接酶将酶切后的SIRT1目的基因与pET-28a(+)载体按照一定的摩尔比例混合，在16℃条件下连接过夜。

转化

将连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，具体步骤为：将连接产物与感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，加入LB液体培养基，37℃振荡培养1h。

取适量培养物涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。

阳性克隆鉴定

挑取单菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

提取质粒，进行双酶切鉴定和测序分析，验证目的基因是否正确插入载体中。

三、在大肠杆菌中的表达

（一）材料与试剂

菌株：含有重组质粒pET-28a(+)-SIRT1的大肠杆菌BL21(DE3)。

培养基：LB液体培养基（含卡那霉素）。

诱导剂：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）。

其他试剂：蛋白质分子量标准、SDS-PAGE相关试剂、Westernblot相关试剂（抗His标签抗体等）。

（二）方法

重组菌的培养与诱导表达

将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600nm为0.6-0.8。

加入IPTG至终浓度为0.5-1mmol/L，在25-37℃条件下继续振荡培养3-6h，诱导SIRT1蛋白的表达。同时设置未诱导的重组菌和空载体转化的菌作为对照。

蛋白的提取

取诱导后的菌液，4℃离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2-3次。

加入适量的裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），超声破碎菌体（冰浴条件下），4℃离心，分别收集上清和沉淀。

SDS-PAGE分析

对提取的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白的表达情况，包括表达量和存在形式（上清或沉淀中）。

Westernblot鉴定

将SDS-PAGE电泳后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭过夜。

加入抗His标签的一抗，室温孵育2h，洗膜后加入二抗，室温孵育1h，再次洗膜，最后通过化学发光显色检测目的蛋白。

四、结果与分析

（一）基因克隆结果

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，得到与预期大小相符的SIRT1目的基因片段，表明PCR扩增