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探寻高效之路：β-地中海贫血基因治疗中杂合型AAV载体的筛选与优化

一、绪论

1.1研究背景

1.1.1β-地中海贫血的发病机制与现状

β-地中海贫血是一种常染色体隐性遗传病，其发病机制主要是由于β-珠蛋白基因的突变，导致β-珠蛋白肽链合成障碍。正常情况下，人类β-珠蛋白基因簇位于11p15.5，包含多个功能基因，这些基因的表达具有发育阶段特异性。而β-地中海贫血患者，其β-珠蛋白基因的点突变或小片段缺失，少数为大片段缺失，使得β-珠蛋白肽链无法正常合成，进而导致血红蛋白的结构和功能异常。例如，β?-突变使得无β-珠蛋白肽链产生；β?-突变则使β-珠蛋白肽链的合成速度下降。

这种基因层面的异常，致使患者体内红细胞中的血红蛋白组成成分改变，红细胞变得脆弱，易于破裂，从而引发慢性溶血性贫血。重型β-地中海贫血患者，由于β链生成完全或几乎完全受到抑制，含有β链的HbA合成减少或消失，多余的α链与γ链结合形成HbF，HbF的氧亲合力高，导致患者组织缺氧。过剩的α链还会沉积于幼红细胞和红细胞中，形成α链包涵体，使红细胞变僵硬，在骨髓内大多被破坏，造成“无效造血”。

β-地中海贫血在全球范围内广泛分布，尤其在地中海地区、北非、撒哈拉沙漠、中东、印度次大陆、中国南方地区、东南亚等地区高发，人群突变携带率为2%-30%。在中国，β-地贫携带率最高的三个省份为广西（6.66%）、海南（5.11%）和贵州（4.63%），广东、云南、香港、湖南、江西等地的携带率也较高。截至2020年，全球已发现超过300种β-地贫突变，但90%以上的病例是由其中40余种突变所致。

根据病情轻重的不同，β-地中海贫血可分为重型、中间型、轻型。重型患者表现为面色苍白、喂养困难、腹泻、头颅变大、额部隆起、颧骨高等，需要长期输血治疗；中间型患者表现为轻中度贫血、脾脏轻中度肿大、黄疸等，不需要输血或偶有输血；轻型患者临床无症状或轻度贫血，脾脏或轻度肿大。β-地中海贫血严重影响患者的身体健康和生活质量，给患者家庭和社会带来沉重的负担。对于重型患者来说，长期的输血治疗不仅费用高昂，还会引发铁过载等并发症，导致心、肝、脾、肾等脏器受损，患者的生命健康受到严重威胁。

1.1.2基因治疗的兴起与挑战

随着医学技术的不断发展，基因治疗为β-地中海贫血的治疗带来了新的希望。基因治疗是一种通过向患者体内引入或修改基因来治疗疾病的方法，其主要目的是修复或替换有缺陷的基因，或引入新的基因来产生所需的蛋白质。对于β-地中海贫血患者而言，基因治疗旨在纠正或补偿异常的β-珠蛋白基因，恢复正常的血红蛋白合成，从而从根本上治疗疾病。

目前，基因治疗β-地中海贫血的策略主要包括基因添加、基因编辑等。基因添加是将正常的β-珠蛋白基因导入患者的造血干细胞中，使其能够表达正常的β-珠蛋白肽链；基因编辑则是通过精确地修改患者自身的β-珠蛋白基因，纠正突变位点，实现基因功能的修复。然而，基因治疗在实际应用中仍面临诸多挑战。

基因治疗需要将治疗基因有效地传递至靶组织，而这一过程面临着重重困难。裸DNA很容易被吞噬细胞或核酸酶从系统中清除，因此需要使用“载体”进行基因递送。虽然病毒载体由于感染效率高、宿主细胞范围广而被广泛应用于基因治疗，但仍存在一些问题。例如，病毒载体可能引发免疫反应，导致机体对载体产生排斥，影响治疗效果，甚至可能带来严重的不良反应；部分病毒载体还存在插入突变的风险，可能会激活原癌基因或抑制抑癌基因的表达，从而增加患癌的风险。此外，如何提高基因治疗的靶向性，使治疗基因能够准确地到达靶细胞，并在靶细胞内稳定表达，也是亟待解决的问题。

在β-地中海贫血的基因治疗中，如何将治疗基因高效地导入造血干细胞，并确保其在体内长期稳定地表达正常的β-珠蛋白肽链，仍然是一个巨大的挑战。目前的基因治疗方法在转导效率、安全性和长期疗效等方面还存在不足，需要进一步探索和优化。

1.2研究目的与意义

1.2.1研究目的

本研究旨在筛选应用于β-地中海贫血基因治疗中的高效转导杂合型AAV载体，具体目标如下：

构建杂合型AAV载体：通过基因工程技术，将不同血清型AAV的优势基因片段进行组合，构建一系列杂合型AAV载体，以期获得具有独特性能的新型载体。

筛选最佳杂合型AAV载体：利用细胞实验和动物模型，对构建的杂合型AAV载体进行转导效率、靶向性和安全性等方面的评估，筛选出在β-地中海贫血基因治疗中表现最佳的杂合型AAV载体。

研究最佳载体的特性与作用机制：深入研究筛选出的最佳杂合型AAV载体的生物学特性，包括