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菊花脂肪酸脱饱和酶基因CmFAD7的克隆与表达分析

摘要

以秋菊（ChrysanthemummorifoliumRamat.）抗寒品种‘星光灿烂’为材料，利用RT-PCR和RACE方法从叶片中克隆了ω-3脂肪酸去饱和酶基因，命名为CmFAD7，GenBank登录号为KC567246。该基因cDNA全长1284bp，编码428个氨基酸，相对分子量为48.98kD，等电点为9.07，编码的氨基酸序列与高山还阳参同源性最高（84%）。该蛋白含有Δ12-FADs保守结构域和3个跨膜螺旋，N端含有一段叶绿体转运肽，属于膜脂肪酸去饱和酶超级家族。采用实时荧光定量PCR和气相色谱法研究低温胁迫下叶片和根系中CmFAD7的表达量及脂肪酸含量变化，CmFAD7在根系和叶片中均有表达，叶片中的表达量高于根系。根系中5℃时表达量最高，叶片中–4℃时最高，在–8℃时叶片和根系表达量均较低；随着处理温度的降低，叶片中C18:3含量呈逐渐上升趋势，根系中变化不明显。结果表明，菊花CmFAD7与抗寒性有关，低温条件下不同器官的表达量有较大差异。

关键词

菊花；脂肪酸脱饱和酶基因；克隆；表达分析

一、引言

菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）是世界著名的观赏花卉，具有极高的观赏价值和经济价值。然而，低温胁迫常常影响菊花的生长发育、品质和产量，限制了其在一些地区的种植和应用。植物在长期进化过程中形成了多种适应低温胁迫的机制，其中脂肪酸不饱和程度的改变在植物抗寒过程中起着重要作用。脂肪酸脱饱和酶（fattyaciddesaturase，FAD）是催化脂肪酸形成不饱和键的关键酶，能够调节膜脂的不饱和脂肪酸含量，进而影响膜的流动性和稳定性，增强植物的抗寒性。ω-3脂肪酸去饱和酶是FAD家族中的重要成员，可催化油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）分别生成亚麻酸（C18:3）和十八碳四烯酸（C18:4）。研究表明，ω-3脂肪酸去饱和酶基因在植物响应低温胁迫过程中发挥着重要作用。本研究旨在克隆菊花ω-3脂肪酸去饱和酶基因CmFAD7，并分析其在低温胁迫下的表达特性，为深入了解菊花抗寒分子机制及培育抗寒菊花新品种提供理论依据。

二、材料与方法

2.1试验材料

试验材料为秋菊抗寒品种‘星光灿烂’，由河南农业大学花卉研究所提供。选取生长健壮、长势一致的植株，置于光照培养箱中培养，培养条件为光照16h/d，温度25℃，相对湿度60%。

2.2总RNA的提取与检测

采用改良CTAB法提取菊花叶片和根系的总RNA。取约0.1g叶片或根系组织，置于液氮中迅速研磨成粉末，转入1.5mL离心管中，加入1mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液（2%CTAB，100mmol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，pH8.0，1.4mol/LNaCl，2%β-巯基乙醇），充分混匀后，于65℃水浴中保温30min，期间每隔10min轻轻颠倒混匀一次。加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），振荡混匀，12000r/min离心15min。吸取上清液，转入新的离心管中，加入1/4体积的10mol/LLiCl溶液，混匀后于4℃放置过夜。12000r/min离心30min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤2次，室温晾干后，加入适量的DEPC处理水溶解RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，以λDNA/HindⅢ为分子量标准。同时，用核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间的RNA样品用于后续试验。

2.3cDNA第一链的合成

以提取的总RNA为模板，采用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链。反应体系为：5×M-MLVBuffer4μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，Oligo（dT）18（0.5μg/μL）1μL，总RNA1μg，M-MLV反转录酶（200U/μL）1μL，RNase抑制剂（40U/μL）0.5μL，DEPC处理水补足至20μL。反应条件为：42℃保温60min，70℃加热10min终止反应。合成的cDNA第一链于-20℃保存备用。

2.4CmFAD7基因中间片段的获得

根据已报道的植物ω-3脂肪酸去饱和酶基因的保守序列，设计一对简并引物FAD7-F和FAD7-R（表1）。以cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。反应体系为：10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，引物