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甜瓜果实PDS基因克隆及β-胡萝卜素积累分子机理研究

摘要

本研究聚焦于甜瓜果实PDS基因，旨在深入探究其克隆过程以及对β-胡萝卜素积累的分子调控机制。通过一系列实验技术，包括RT-PCR和RACE技术克隆PDS基因，构建反义表达载体并进行遗传转化，利用荧光定量PCR分析基因表达等。研究结果表明，PDS基因在甜瓜果实β-胡萝卜素积累过程中发挥着关键作用，其表达模式与β-胡萝卜素含量变化密切相关，为进一步理解甜瓜果实品质形成机制以及通过基因工程手段改良果实品质提供了重要的理论依据。

关键词

甜瓜果实；PDS基因；克隆；β-胡萝卜素；分子机理

一、引言

1.1研究背景

甜瓜（CucumismeloL.）作为一种重要的园艺作物，其果实品质备受关注。β-胡萝卜素不仅赋予甜瓜果实鲜艳的色泽，还具有重要的营养价值，作为维生素A的前体，对人体健康有着诸多益处，如抗氧化、增强免疫力等。类胡萝卜素生物合成途径中，八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是一个关键的限速酶，它催化无色的八氢番茄红素逐步脱氢生成有色的类胡萝卜素，在植物色素合成和光保护等过程中发挥着不可或缺的作用。深入研究甜瓜果实PDS基因及其对β-胡萝卜素积累的调控机制，对于揭示甜瓜果实品质形成的分子基础以及通过基因工程手段培育高品质甜瓜品种具有重要意义。

1.2研究目的与意义

本研究旨在克隆甜瓜果实PDS基因，分析其序列特征，并深入探究该基因在β-胡萝卜素积累过程中的分子调控机理。通过对PDS基因的研究，一方面可以丰富我们对甜瓜果实类胡萝卜素生物合成途径的认识，填补该领域在甜瓜研究中的部分空白；另一方面，为通过基因编辑或转基因技术调控甜瓜果实β-胡萝卜素含量，进而改善果实品质、提高营养价值提供理论支撑和技术靶点。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

选用具有代表性的橙色果肉甜瓜品种Homoka和白色果肉甜瓜品种M01-3作为实验材料。将甜瓜种子播种于温室中，按照常规栽培管理措施进行培育，在甜瓜生长发育的不同时期，采集果实样本用于后续实验分析。

2.1.2主要试剂与仪器

Trizol试剂、反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自知名生物试剂公司。PCR仪、凝胶成像系统、高效液相色谱仪（HPLC）、荧光定量PCR仪等为实验常用仪器。

2.2实验方法

2.2.1甜瓜果实PDS基因的克隆及测序

总RNA的提取：采用Trizol试剂法提取甜瓜果实不同发育时期的总RNA。将采集的果实样品迅速放入液氮中速冻，然后在研钵中充分研磨成粉末状，加入适量Trizol试剂，按照试剂盒说明书进行操作，提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测RNA的完整性和浓度。

cDNA第一链的合成：以提取的总RNA为模板，利用反转录试剂盒合成cDNA第一链。反应体系和反应条件按照试剂盒说明书进行设置，反应结束后，将cDNA产物保存于-20℃备用。

PDS基因的扩增：根据已报道的甜瓜PDS基因保守序列设计特异性引物，采用RT-PCR技术扩增PDS基因片段。PCR反应体系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，利用凝胶回收试剂盒回收纯化。

RACE技术扩增PDS基因全长：采用RACE技术扩增PDS基因的5’和3’末端序列。根据已获得的PDS基因中间片段设计特异性巢式引物，利用RACE试剂盒进行反应。反应产物同样经琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化后，连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序。将获得的中间片段序列与RACE扩增得到的末端序列进行拼接，得到PDS基因的全长cDNA序列。

2.2.2PDS基因反义表达载体的构建及对甜瓜的遗传转化

反义表达载体的构建：用限制性内切酶分别对克隆得到的PDS基因片段和表达载体pBI121进行双酶切，酶切产物经凝胶回收后，利用DNA连接酶将PDS基因片段反向连接到pBI121载体的CaMV35S启动子下游，构建PDS基因反义表达载体pBI121-PDS（as）。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌落PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆，提取质粒进行测序验证。

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