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淇河鲫穿孔素基因的克隆与表达研究

摘要

本研究旨在对淇河鲫穿孔素基因进行克隆与表达分析。通过RT-PCR和RACE技术，成功克隆出淇河鲫穿孔素基因（PFP）cDNA全长序列。生物信息学分析显示，淇河鲫PFP基因具有典型的穿孔素结构域。实时荧光定量PCR检测结果表明，PFP基因在淇河鲫不同组织中均有表达，其中在脾脏和头肾中表达量较高。在PolyI:C、PHA诱导以及嗜水气单胞菌感染后，淇河鲫PFP基因表达水平呈现显著变化。本研究为深入了解淇河鲫免疫防御机制提供了基础数据，也为鱼类疾病防治提供了新的理论依据。

关键词

淇河鲫；穿孔素基因；克隆；表达

一、引言

淇河鲫（CarassiusauratusinQiheRiver）是一种具有重要经济价值的淡水鱼类，主要分布于我国河南省淇河流域。因其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱。然而，随着养殖规模的不断扩大，淇河鲫面临着多种疾病的威胁，如由嗜水气单胞菌引起的败血症等，给养殖业带来了巨大的经济损失。

穿孔素（perforin，PFP）是一种在免疫细胞中表达的糖蛋白，在细胞介导的免疫反应中发挥着关键作用。当效应细胞（如细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞）识别并结合靶细胞后，穿孔素会从效应细胞的胞质颗粒中释放出来，插入靶细胞膜，形成跨膜孔道，导致靶细胞渗透压改变，最终引发靶细胞凋亡或坏死。穿孔素在鱼类免疫防御系统中同样具有重要地位，研究鱼类穿孔素基因对于理解鱼类免疫机制以及疾病防控具有重要意义。目前，关于淇河鲫穿孔素基因的研究尚未见报道，本研究旨在克隆淇河鲫穿孔素基因，并对其在不同组织及免疫刺激条件下的表达模式进行分析，为深入研究淇河鲫免疫防御机制提供理论基础。

二、材料与方法

2.1实验材料

淇河鲫，体重（100±10）g，购自淇河鲫鱼养殖场。实验前，将淇河鲫暂养于实验室循环水养殖系统中，水温（25±1）℃，充氧，暂养1周，期间投喂商业饲料，使其适应实验室环境。

PolyI:C（聚肌胞苷酸）、PHA（植物血凝素）、Trizol试剂、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒、RACE试剂盒、pMD18-T载体、感受态细胞DH5α等均购自宝生物工程（大连）有限公司。限制性内切酶、DNA连接酶等购自NewEnglandBiolabs公司。实时荧光定量PCR试剂盒购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。其他常规试剂均为国产分析纯。

2.2总RNA的提取

分别取淇河鲫的肝脏、脾脏、头肾、心脏、肌肉、肠、鳃等组织约100mg，放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状。按照Trizol试剂说明书进行总RNA的提取。提取后的RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，A260/A280比值在1.8-2.0之间的RNA样品用于后续实验。

2.3cDNA第一链的合成

取1μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。反应体系为20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMix1μL，Oligo(dT)18Primer1μL，Random6mers1μL，总RNA1μg，RNaseFreedH2O补足至20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA第一链于-20℃保存备用。

2.4穿孔素基因中间片段的扩增

根据GenBank中已登录的其他鱼类穿孔素基因保守序列，利用PrimerPremier5.0软件设计一对简并引物PFP-F1和PFP-R1（表1）。以cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMix（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O补足至25μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带，连接到pMD18-T载体上，转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆进行测序。

2.5穿孔素基因cDNA全长的获得

2.5.13-RACE扩增

根据已获得的穿孔素基因中间片段序列，设计3-RACE特异性引物PFP-3GSP1和PFP-3GSP2（表1）。以cDNA第一链为模板，