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洋葱AcChsA与AcANS基因启动子的克隆与表达分析

摘要

本研究旨在克隆洋葱（AlliumcepaL.）的AcChsA和AcANS基因启动子，并对其表达特性进行分析。通过PCR技术从洋葱基因组DNA中扩增得到AcChsA和AcANS基因的启动子序列，分别构建了由这两个启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体，利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析。序列分析显示，AcChsA和AcANS基因启动子包含多种顺式作用元件，如TATA-box、CAAT-box等基本元件，以及与光响应、激素应答、逆境响应相关的元件和MYB转录因子结合位点。瞬时表达结果表明，AcChsA和AcANS基因启动子均具有启动活性，且在不同组织和处理条件下表现出差异表达模式。本研究为深入了解洋葱花青素合成途径的转录调控机制提供了基础，有助于进一步开展洋葱品质改良的相关研究。

关键词

洋葱；AcChsA基因；AcANS基因；启动子克隆；表达分析

一、引言

洋葱（AlliumcepaL.）作为全球广泛种植的重要蔬菜作物，具有丰富的营养价值和多种保健功能。洋葱的颜色主要由花青素等色素决定，花青素不仅赋予洋葱丰富的色泽，还具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物活性，对人体健康有益。查尔酮合成酶（Chalconesynthase，CHS）和花青素合成酶（Anthocyanidinsynthase，ANS）是花青素合成途径中的关键酶，分别催化柚皮素查尔酮的合成以及无色花青素向有色花青素的转化，对花青素的生物合成起着至关重要的作用。

启动子是基因表达调控的重要元件，位于基因编码区上游，能够与RNA聚合酶及其他转录因子相互作用，启动基因的转录过程。对基因启动子的研究有助于深入了解基因表达调控的分子机制。通过克隆和分析洋葱AcChsA和AcANS基因的启动子，明确其顺式作用元件和表达特性，能够为揭示洋葱花青素合成的转录调控网络提供关键信息，为通过基因工程手段改良洋葱品质，提高花青素含量奠定理论基础。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

选用紫色洋葱品种‘红皮洋葱’，种植于山东农业科学院试验田。取洋葱的叶片、鳞片叶、根等组织，液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。

2.1.2菌株与载体

大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α感受态细胞用于质粒的扩增与保存；根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101用于植物表达载体的转化；植物表达载体pCAMBIA1301含有GUS报告基因，用于构建启动子驱动GUS基因的重组载体。

2.1.3主要试剂

DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自TaKaRa公司；其他常规化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2.2实验方法

2.2.1洋葱基因组DNA的提取

采用CTAB法提取洋葱不同组织的基因组DNA。具体步骤如下：取约0.1g洋葱组织，在液氮中研磨成粉末状，迅速转移至含有700μL预热（65℃）CTAB提取缓冲液（2%CTAB，100mMTris-HCl，pH8.0，20mMEDTA，1.4MNaCl）的离心管中，轻轻颠倒混匀，65℃水浴30min，期间每隔10min轻轻颠倒混匀一次。加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀10min，12000rpm离心15min。将上清液转移至新的离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见白色絮状DNA沉淀，-20℃放置30min。12000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干后加入适量的TE缓冲液（10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA）溶解DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，并用核酸蛋白测定仪测定DNA的浓度和纯度。

2.2.2AcChsA和AcANS基因启动子的克隆

根据GenBank中已公布的洋葱AcChsA和AcANS基因序列，利用在线软件Premier5.0设计特异性引物，引物序列如下：

AcChsA-F：5-[具体引物序列1]-3

AcChsA-R：5-[具体引物序列2]-3

AcANS-F：5-[具体引物序列3]-3

AcANS-R：5-[具体引物序列4]-3

以提取的洋葱基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）：10×PCRBuffer2.5μL，d