大肠杆菌过表达EutJ、EutG对庆大霉素的耐药性分析.docx

研究报告

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大肠杆菌过表达EutJ、EutG对庆大霉素的耐药性分析

一、实验材料与方法

1.大肠杆菌菌株的来源与培养

(1)本实验所使用的大肠杆菌菌株为大肠杆菌O157:H7，该菌株广泛用于生物学和微生物学的研究，具有较强的代表性和研究价值。菌株的来源为我国某知名生物研究机构，经过严格的筛选和鉴定，确保其纯度和稳定性。菌株在实验前经过多次传代，以保证其生物学特性的稳定性。在实验过程中，大肠杆菌O157:H7采用标准的液体培养基进行培养，具体为M9培养基，其中含有0.5%的葡萄糖和1.5%的NaCl。培养温度设定为37℃，以确保菌株的最佳生长条件。

(2)在实验前，对大肠杆菌O157:H7进行了详细的生理生化特性分析，包括革兰氏染色、氧化酶试验、葡萄糖发酵试验等。结果表明，该菌株具有典型的革兰氏阴性菌特征，能够利用葡萄糖作为碳源和能源。此外，菌株对多种抗生素具有敏感性，如氨苄西林、链霉素和庆大霉素等，这为后续的耐药性研究提供了便利。在培养过程中，菌株的生长曲线表现出典型的对数生长期和稳定期，其中对数生长期大约持续6小时，稳定期持续约12小时。通过对菌株生长曲线的分析，可以精确控制实验条件，保证实验结果的可靠性。

(3)为了确保实验数据的准确性和一致性，本研究对大肠杆菌O157:H7的菌种进行了严格的保藏。菌种保藏采用冷冻干燥法，将菌株接种于含有甘油和M9培养基的冷冻管中，在-80℃下保存。在实验前，将冷冻管从低温冰箱中取出，复溶于适量的M9培养基中，即可恢复菌株的活性。这种保藏方法能够有效保持菌株的遗传稳定性，减少实验过程中由于菌种退化导致的误差。在实际操作中，我们采用该方法保藏的菌株在复溶后，其生长速率和生理生化特性与原菌株基本一致，为后续实验提供了可靠的菌种来源。

2.重组质粒的构建

(1)重组质粒的构建是本实验的关键步骤之一，我们选择了携带EutJ和EutG基因的质粒载体pET28a。首先，通过PCR技术从大肠杆菌基因组中扩增出EutJ和EutG基因，扩增产物经过纯化后进行测序验证。EutJ基因长度为1200bp，EutG基因长度为1500bp，均成功克隆到pET28a载体上。在构建过程中，我们使用了BamHI和XhoI酶切位点，以确保基因插入到载体中的正确位置。通过酶切和连接反应，成功构建了pET28a-EutJ和pET28a-EutG重组质粒。

(2)为了验证重组质粒的构建是否成功，我们进行了PCR和酶切鉴定。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，观察到预期的EutJ和EutG基因条带，大小分别为1200bp和1500bp。此外，我们还对重组质粒进行了酶切分析，结果显示EutJ和EutG基因在BamHI和XhoI酶切位点处被成功切割，释放出大小与预期相符的DNA片段。这一结果表明，EutJ和EutG基因已成功插入到pET28a载体中。

(3)为了进一步验证重组质粒的稳定性，我们将pET28a-EutJ和pET28a-EutG重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。转化后，通过抗生素筛选，成功筛选出阳性克隆。对阳性克隆进行PCR和酶切鉴定，结果与预期一致。为了确保重组质粒的稳定性，我们还对转化后的菌株进行了多次传代培养，观察其生长情况。结果表明，经过多次传代后，重组质粒仍然稳定存在，为后续的蛋白表达实验提供了可靠的质粒载体。

3.重组大肠杆菌的筛选与鉴定

(1)在成功构建pET28a-EutJ和pET28a-EutG重组质粒后，我们进行了大肠杆菌BL21(DE3)菌株的转化实验。转化过程包括将重组质粒与感受态细胞混合、热冲击、冷冲击和复苏等步骤。转化效率通过涂布在含有氨苄西林的LB平板上计算，结果显示转化效率约为1×10^8CFU/μg质粒。在平板上，我们观察到多个白色菌落，这些菌落可能是转化成功的阳性克隆。

(2)为了从这些白色菌落中筛选出含有重组质粒的菌株，我们进行了进一步的PCR鉴定。从每个白色菌落中提取DNA，进行EutJ和EutG基因的特异性PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳分析，我们观察到预期大小的DNA条带，其中EutJ基因条带大小为1200bp，EutG基因条带大小为1500bp。这一结果表明，部分白色菌落确实含有目的基因，是潜在的重组菌株。

(3)为了进一步验证这些重组菌株的蛋白表达情况，我们进行了蛋白质印迹（Westernblot）分析。将重组菌株培养至对数生长期，收集细胞裂解物，进行SDS电泳。随后，将蛋白质转移到PVDF膜上，并用抗EutJ和EutG的多克隆抗体进行孵育。结果显示，在预期分子量位置出现了明显的条带，表明EutJ和EutG蛋白在重组菌株中得到有效表达。通过对比不同重组菌株的表达水平，我们发现pET28a-EutJ重组菌株的表达量高于