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棉铃虫HaABCC2基因克隆及mRNA表达研究

一、引言

棉铃虫作为一种重要的农业害虫，对棉花等多种作物造成严重危害。ABCC2基因属于ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族中的C亚家族成员，在昆虫的解毒代谢、物质转运等生理过程中发挥着重要作用。开展棉铃虫HaABCC2基因的克隆及mRNA表达研究，有助于深入了解该基因的功能，为棉铃虫的防治提供新的思路和靶点。

二、棉铃虫HaABCC2基因克隆

（一）实验材料

供试昆虫：选取健康的棉铃虫幼虫，在实验室条件下饲养至合适龄期，用于后续的基因克隆实验。

主要试剂：Trizol试剂、反转录酶、DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶、琼脂糖、引物等，均购自知名生物试剂公司，且符合实验要求。

实验仪器：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、超净工作台等。

（二）总RNA提取与cDNA合成

取棉铃虫幼虫的适当组织，按照Trizol试剂说明书进行总RNA的提取。提取过程中要严格避免RNA酶的污染，以保证RNA的完整性和纯度。

采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对提取的总RNA进行质量检测。若RNA条带清晰，无明显降解，且OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，则说明RNA质量良好，可用于后续实验。

以提取的总RNA为模板，根据反转录酶说明书进行cDNA的合成。合成的cDNA置于-20℃冰箱中保存备用。

（三）引物设计与PCR扩增

根据已报道的其他昆虫ABCC2基因的保守序列，利用引物设计软件设计棉铃虫HaABCC2基因的特异性引物。引物设计需考虑引物的长度、GC含量、退火温度等因素，以确保PCR扩增的特异性和效率。

以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等，按照一定的比例配制。

PCR反应程序设置为：预变性95℃5min；然后变性95℃30s，退火（根据引物的Tm值设定）30s，延伸72℃（根据目的基因的长度设定延伸时间），进行35个循环；最后72℃延伸10min。

（四）目的片段的回收与克隆

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切取含有目的片段的凝胶块，使用凝胶回收试剂盒回收目的片段。

将回收的目的片段与T载体连接，连接体系包括目的片段、T载体、连接酶、缓冲液等，在16℃条件下连接过夜。

将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

挑取单菌落进行培养，提取质粒，通过限制性内切酶酶切和PCR鉴定，筛选出阳性克隆。

（五）测序与序列分析

将阳性克隆送测序公司进行测序。对测序得到的序列进行分析，包括与其他物种ABCC2基因的同源性比对、开放阅读框（ORF）预测、氨基酸序列推导等，确定所克隆的基因为棉铃虫HaABCC2基因。

三、棉铃虫HaABCC2基因mRNA表达分析

（一）实验材料与方法

供试昆虫：选取不同发育阶段（卵、幼虫、蛹、成虫）的棉铃虫，以及同一龄期幼虫的不同组织（中肠、脂肪体、体壁、头部等），用于mRNA表达分析。

总RNA提取与cDNA合成：同基因克隆部分。

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：设计HaABCC2基因的特异性qRT-PCR引物，以棉铃虫的内参基因（如β-actin基因）作为参照。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、荧光定量PCR混合液等，在实时荧光定量PCR仪上进行反应。反应程序设置为：预变性95℃30s；然后变性95℃5s，退火60℃30s，进行40个循环。每个样品设置3个重复。

（二）数据分析

采用2-ΔΔCt法对qRT-PCR数据进行分析，计算HaABCC2基因在不同发育阶段和不同组织中的相对表达量。使用统计学软件对数据进行差异显著性分析，P0.05表示差异显著。

（三）结果与分析

不同发育阶段的mRNA表达：HaABCC2基因在棉铃虫的不同发育阶段均有表达，但表达量存在显著差异。在幼虫期，随着龄期的增加，表达量逐渐升高，在老熟幼虫期达到高峰；在蛹期和成虫期，表达量相对较低。这表明HaABCC2基因可能在棉铃虫幼虫的生长发育过程中发挥重要作用。

不同组织的mRNA表达：HaABCC2基因在棉铃虫幼虫的中肠组织中表达量最高，其次是脂肪体和体壁，在头部的表达量最低。中肠是昆虫消化和解毒的重要器官，这一结果提示HaABCC2基因可能参与棉铃虫的解毒代谢过程。

不同诱导条件下的mRNA表达：研究了不同药剂（如杀虫剂）处理对棉铃虫HaABCC2基因mRNA表达