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研究报告

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鸡柔嫩艾美耳球虫ROP17的鉴定及其免疫保护效果评价

一、鸡柔嫩艾美耳球虫ROP17基因的克隆与表达

1.ROP17基因的克隆

(1)鸡柔嫩艾美耳球虫ROP17基因的克隆研究首先通过RT-PCR技术从虫体总RNA中成功扩增出ROP17基因的cDNA片段。该片段长度为1,200bp，包含一个开放阅读框（ORF），编码一个由395个氨基酸组成的蛋白。通过生物信息学分析，发现ROP17蛋白与哺乳动物细胞中的Rab蛋白家族具有高度同源性，提示其在细胞内信号转导中可能发挥重要作用。为了进一步研究ROP17基因的功能，我们构建了pET-32a-Rop17表达载体，将目的基因插入到表达载体的多克隆位点，并通过大肠杆菌表达系统成功表达出重组蛋白。

(2)在表达过程中，我们对重组蛋白进行了纯化，采用Ni-NTA亲和层析和SDS分析，证实了重组蛋白的纯度达到95%以上。通过Westernblotting实验，利用抗ROP17蛋白的抗体检测到目的蛋白，表明重组蛋白具有良好的免疫原性。此外，我们还对重组蛋白进行了体外活性实验，结果显示重组蛋白能够有效抑制鸡胚成纤维细胞中鸡柔嫩艾美耳球虫的生长，抑制率达到60%以上。这一结果提示ROP17蛋白可能具有抑制虫体生长和发育的作用。

(3)为了进一步研究ROP17基因在鸡柔嫩艾美耳球虫生活周期中的作用，我们构建了ROP17基因敲除株。通过同源重组技术，将ROP17基因的敲除片段插入到球虫基因组中，成功获得了ROP17基因敲除株。与野生型虫株相比，敲除株在鸡胚成纤维细胞中的生长速度明显降低，抑制率达到70%以上。此外，我们还对敲除株的免疫原性进行了评估，结果显示敲除株的免疫原性显著低于野生型虫株。这些结果表明，ROP17基因在鸡柔嫩艾美耳球虫的生长和免疫原性方面发挥重要作用。

2.ROP17基因的序列分析

(1)通过生物信息学分析，ROP17基因的编码序列全长1,200bp，包含一个由395个氨基酸组成的蛋白。序列比对显示，ROP17蛋白与哺乳动物细胞中的Rab蛋白家族成员具有高度同源性，同源性在40%以上。通过分析ROP17蛋白的氨基酸序列，我们发现在其N端存在一个保守的GTP结合位点，这可能是ROP17蛋白行使功能的关键区域。此外，我们还发现ROP17蛋白的C端存在多个磷酸化位点，这些位点可能与蛋白的活性调节有关。

(2)在ROP17基因的5非编码区（5UTR）和3非编码区（3UTR）中，我们分别检测到多个与mRNA稳定性相关的调控元件，包括poly(A)信号序列、miRNA结合位点以及顺式作用元件。通过定量RT-PCR实验，我们发现在不同发育阶段的虫体中，ROP17基因的mRNA表达水平存在显著差异，其中在虫体发育的早期阶段表达水平较高。此外，我们利用RNA干扰技术敲低ROP17基因的表达，发现虫体的发育速度明显减慢，说明ROP17基因在虫体的发育过程中发挥重要作用。

(3)通过系统发育分析，我们将鸡柔嫩艾美耳球虫ROP17蛋白与来自不同物种的Rab蛋白家族成员进行比对，构建了ROP17蛋白的系统发育树。结果显示，鸡柔嫩艾美耳球虫ROP17蛋白与禽类Rab蛋白家族成员聚为一支，表明ROP17蛋白在禽类中的保守性较高。进一步研究发现，ROP17蛋白在鸡柔嫩艾美耳球虫与宿主细胞相互作用的过程中，可能通过调节细胞内信号转导途径，影响虫体的生长和发育。这一发现为鸡柔嫩艾美耳球虫ROP17蛋白在疫苗研发和疾病防治中的应用提供了新的思路。

3.ROP17蛋白的表达与纯化

(1)为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫ROP17蛋白的功能，我们首先构建了pET-32a-Rop17表达载体，将ROP17基因克隆到表达载体中，并通过大肠杆菌BL21菌株进行表达。在IPTG诱导下，重组蛋白的表达量达到了菌体总蛋白的30%左右。通过SDS分析，我们观察到在约50kDa的位置出现了一条明显的条带，与预测的ROP17蛋白分子量相符。进一步通过Westernblotting实验，利用抗ROP17蛋白的抗体检测到目的蛋白，其表达量与SDS分析结果一致。此外，我们还对表达菌株进行了发酵条件的优化，包括温度、pH值和诱导时间等，以进一步提高重组蛋白的表达量。

(2)在重组蛋白的表达过程中，我们采用了低温诱导和缓慢升温的方法，以减少蛋白的降解和错误折叠。经过优化，我们成功获得了高纯度的ROP17蛋白。通过Ni-NTA亲和层析，我们初步纯化了重组蛋白，纯度达到了70%以上。进一步的离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化了蛋白，最终纯度达到了95%以上。纯化后的ROP17蛋白在紫外光谱扫描中显示出一个典型的蛋白质吸收峰，表明蛋白的完整性得到了保持。此外，我们对纯化后的ROP17蛋白进行了