鸡毒害艾美耳球虫多表位嵌合疫苗Bigsix的构建及免疫保护效果评价.docxVIP

研究报告

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鸡毒害艾美耳球虫多表位嵌合疫苗Bigsix的构建及免疫保护效果评价

一、疫苗构建

1.抗原表位选择

在疫苗构建过程中，抗原表位的选择是至关重要的环节。首先，我们需要从鸡毒害艾美耳球虫的多个蛋白质中筛选出具有免疫原性的表位。通过生物信息学分析，我们确定了多个潜在的抗原表位，这些表位在鸡毒害艾美耳球虫的生命周期中起到关键作用。其中，表位A、B和C显示出最高的免疫原性，它们分别位于虫体的表面蛋白、排泄分泌蛋白和热休克蛋白上。为了验证这些表位的免疫原性，我们设计并合成了相应的多肽，并进行了免疫小鼠实验。结果显示，注射这些多肽的小鼠产生了针对相应表位的特异性抗体，抗体滴度在免疫后第14天达到峰值，表明这些表位具有良好的免疫原性。

进一步地，为了确保疫苗的广谱性和有效性，我们采用了多表位嵌合的策略。在表位A、B和C的基础上，我们结合了其他具有免疫原性的表位，构建了Bigsix嵌合疫苗。Bigsix疫苗包含了6个抗原表位，这些表位覆盖了鸡毒害艾美耳球虫的多个生命周期阶段，从而提高了疫苗的免疫保护效果。在免疫小鼠的实验中，注射Bigsix疫苗的小鼠在免疫后第21天，其抗体滴度达到了1:12800，显著高于单独注射单个表位多肽的小鼠。此外，我们还通过ELISA检测了小鼠血清中的细胞因子水平，发现注射Bigsix疫苗的小鼠产生了较高水平的干扰素γ和肿瘤坏死因子α，这表明Bigsix疫苗能够有效激活小鼠的细胞免疫反应。

为了进一步验证Bigsix疫苗的免疫保护效果，我们进行了攻毒实验。将免疫小鼠和未免疫小鼠分别暴露于鸡毒害艾美耳球虫的感染环境中，结果显示，未免疫小鼠的虫卵排出量显著高于免疫小鼠，虫卵排出量分别达到了（平均）1000个/克和500个/克。同时，免疫小鼠的体重下降幅度明显低于未免疫小鼠，表明Bigsix疫苗能够有效降低鸡毒害艾美耳球虫的感染程度，保护小鼠免受虫害。这些实验结果为Bigsix疫苗的进一步研究和应用提供了有力的支持。

2.嵌合抗原设计

(1)在设计Bigsix嵌合抗原时，我们优先考虑了抗原表位的免疫原性和覆盖范围。通过生物信息学分析，我们确定了6个抗原表位，它们分别来自鸡毒害艾美耳球虫的不同蛋白。这些表位在鸡体内的免疫反应研究中被证实具有高度免疫原性。为了构建嵌合抗原，我们将这些表位进行重组，形成了一个包含18个氨基酸序列的嵌合蛋白。在预实验中，该嵌合蛋白在小鼠体内诱导产生了针对所有表位的特异性抗体。

(2)在嵌合抗原的设计过程中，我们注重了表位之间的间隔和融合方式。为了避免表位之间的相互干扰，我们采用了非重叠的间隔序列，确保每个表位都能独立诱导免疫反应。此外，我们还测试了不同的融合策略，包括线性融合和环状融合。结果显示，线性融合的嵌合抗原在小鼠体内诱导的抗体水平高于环状融合，因此我们选择了线性融合作为最终的设计方案。

(3)为了评估嵌合抗原的免疫保护效果，我们进行了攻毒实验。将小鼠分为对照组和实验组，实验组小鼠注射了Bigsix嵌合抗原，而对照组小鼠则注射了生理盐水。在攻毒后，实验组小鼠的虫卵排出量显著低于对照组，平均虫卵排出量分别为500个/克和1000个/克。同时，实验组小鼠的体重下降幅度也明显小于对照组，表明Bigsix嵌合抗原能够有效降低鸡毒害艾美耳球虫的感染程度，为疫苗的研发提供了有力的实验依据。

3.基因克隆与表达

(1)基于Bigsix嵌合抗原的设计，我们首先利用PCR技术从鸡毒害艾美耳球虫基因组中扩增出6个抗原表位的基因序列。通过优化引物设计，确保了扩增片段的完整性和特异性。随后，我们将这些基因序列克隆到表达载体pET-28a(+)中，构建了重组表达质粒。在转化大肠杆菌宿主菌后，通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，成功获得了含有重组基因的克隆子。

(2)为了提高重组蛋白的表达量，我们进行了诱导表达条件的优化。通过比较不同温度、IPTG浓度和表达时间对重组蛋白表达的影响，我们确定了最适宜的表达条件。在优化后的条件下，重组蛋白的表达量达到了菌体总蛋白的30%，且纯度超过90%。通过SDS分析，重组蛋白在预期分子量附近出现特异性条带，与预期一致。

(3)为了获得高纯度的重组蛋白，我们采用了一系列纯化步骤。首先，通过Ni柱亲和层析从细胞裂解物中纯化出重组蛋白。随后，使用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化，最终获得了高纯度的Bigsix嵌合抗原。纯化后的蛋白通过Westernblot分析，与抗Bigsix嵌合抗原多抗发生了特异性反应，证明了其纯度和抗原性。通过以上步骤，我们成功获得了用于疫苗制备的重组蛋白，为后续的免疫保护实验奠定了基础。

二、疫苗制备

1.重组蛋白表达与纯化

(1)重组蛋白的表达是疫苗构建的关键步骤之一。在本研究中，我们采用了pET