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无选择标记系统的构建及其在转基因大豆中的应用与探索

一、引言

1.1研究背景

自1973年基因克隆技术诞生，1982年全球首例转基因烟草诞生以来，转基因技术发展迅猛。1996年转基因作物开始大规模商业化种植，其种植面积从最初的百万公顷增长到2023年的近两亿公顷，先后有29个主要粮食生产国批准了转基因作物的商业化种植，42个国家进口转基因产品作为食品或饲料、工业原料。在众多转基因作物中，转基因大豆占据着重要地位。大豆是国际上最早实现转基因技术商业化应用的农作物，其年种植面积近1亿hm2，占转基因作物总面积的一半以上。在转基因作物总种植面积和产量均居世界前3位的美国、巴西和阿根廷，转基因大豆面积占比均达到90%以上。

转基因大豆具有诸多优良特性。一方面，通过转入抗虫基因，使其能够抵御常见害虫侵害，减少农药使用量，降低生产成本和环境污染；另一方面，转入耐除草剂基因，使大豆可以耐受特定除草剂，便于田间除草管理，提高种植效率，在某些情况下还有助于增加大豆产量。例如，孟山都研发的转基因大豆，通过转入相关基因，成功实现了抗虫和耐除草剂的特性，在全球范围内得到广泛种植。这些优良特性使得转基因大豆在农业生产中发挥着重要作用，为保障粮食安全和提高农业生产效益做出了贡献。

然而，在转基因大豆的培育过程中，标记基因的使用带来了一系列问题。为了提高对转化细胞的筛选效率，在转基因过程中不可避免地引入了标记基因，如抗生素抗性标记基因和除草剂抗性标记基因等。这些标记基因可能存在安全性隐患，抗生素抗性标记基因有水平转移和基因逃逸的风险，可能导致微生物获得抗性，影响抗生素在医疗领域的有效性；除草剂抗性标记基因则存在生态风险，可能影响非目标生物，破坏生态平衡。标记基因的存在还可能影响转化细胞再生以及多重转化，限制了转基因技术的进一步发展和应用。例如，在一些研究中发现，标记基因的存在会对植物的生长发育产生负面影响，导致植物表型异常。因此，构建无选择标记系统对于转基因大豆的安全应用和可持续发展具有重要意义，它能够有效解决标记基因带来的潜在风险，推动转基因大豆技术的健康发展。

1.2研究目的与意义

本研究旨在构建一种高效、安全的无选择标记系统，并将其应用于转基因大豆中，以解决传统转基因技术中标记基因带来的诸多问题。通过深入研究无选择标记系统在转基因大豆中的作用机制和应用效果，为转基因大豆的可持续发展提供理论支持和技术保障。

从技术层面来看，传统的转基因技术依赖于标记基因进行转化细胞的筛选，然而这些标记基因不仅存在潜在的生物安全风险，还可能对植物的生长发育产生负面影响。构建无选择标记系统可以避免这些问题，提高转基因大豆的安全性和质量。此外，该系统还能够简化转基因操作流程，降低生产成本，提高转基因技术的效率和可行性。

在生态安全方面，传统转基因大豆中的标记基因可能通过水平转移或基因逃逸等方式进入野生植物或微生物中，对生态环境造成潜在威胁。而无选择标记系统的应用可以有效降低这种风险，减少对生态平衡的破坏。同时，避免了标记基因可能对非目标生物产生的影响，保护了生物多样性。

从社会经济角度分析，随着消费者对食品安全和环境保护意识的不断提高，对转基因产品的安全性要求也越来越严格。无选择标记的转基因大豆能够更好地满足消费者的需求，减少公众对转基因技术的担忧，从而促进转基因大豆的市场接受度和应用推广。这将有助于提高我国大豆产业的竞争力，保障国家粮食安全，推动农业经济的可持续发展。

1.3国内外研究现状

1.3.1无选择标记系统构建的研究现状

无选择标记系统的构建一直是转基因技术研究的重要领域，国内外众多科研团队投入大量精力进行探索，取得了一系列具有重要价值的成果。在早期的研究中，共转化技术作为一种较为基础的手段被广泛应用。这种技术利用农杆菌介导，将携带目的基因和标记基因的不同质粒共同导入受体细胞。例如在烟草、拟南芥、水稻等植物的研究中，通过共转化技术成功实现了目的基因和标记基因的导入，并且在部分后代植株中，利用遗传重组使选择标记与目的基因分离，从而获得无选择标记的转基因植株。但该技术存在一定局限性，对于马铃薯、甘蔗等无性繁殖植物以及多年生植物并不适用，限制了其应用范围。

随着研究的深入，位点特异性重组系统逐渐成为研究热点。其中，Cre/loxP系统是最为典型的代表之一。该系统利用Cre重组酶识别loxP位点，实现位点间DNA片段的切除或重组。在转基因大豆的研究中，通过对可化学诱导的Cre/loxP位点特异性DNA重组体系pX6_GFP载体进行改造，构建出能够在转基因大豆种子中表达各种目标产物且不含选择标记的表达载体pXB。研究表明，在大豆转化植株中，经过β-雌二醇诱导，植株基因组中两个loxP位点之