猪干扰素α的原核可溶性表达及抗PEDV活性.docxVIP

研究报告

PAGE

1-

猪干扰素α的原核可溶性表达及抗PEDV活性

一、猪干扰素α原核表达系统构建

1.表达载体的选择

(1)在选择表达载体时，首先需考虑其宿主菌的兼容性。由于猪干扰素α是一种在哺乳动物细胞中表达较为高效的蛋白，因此选择具有哺乳动物细胞表达系统特征的宿主菌如大肠杆菌作为表达宿主，是构建表达载体的首选。大肠杆菌表达系统具有操作简便、成本低廉等优点，但需注意其表达产物的折叠和后修饰能力有限，可能导致表达产物的活性降低。

(2)其次，表达载体的选择还需考虑其启动子、终止子和质粒拷贝数的特性。启动子是驱动基因转录的关键元件，选择与宿主菌兼容且启动效率高的启动子，如大肠杆菌的pET系列载体中的T7启动子，有助于提高猪干扰素α的表达水平。终止子则负责终止转录过程，选择与启动子相匹配的终止子，可以确保转录的准确性。此外，质粒拷贝数也会影响表达产物的产量，适当提高质粒拷贝数可以提高表达水平，但过高可能会导致细胞生长压力增大，影响细胞生长和表达效率。

(3)此外，表达载体还应具备易于克隆、鉴定和操作的特点。例如，载体上应包含多个克隆位点，便于插入目的基因；同时，载体上应包含便于筛选和鉴定的标记基因，如抗生素抗性基因，以便于在筛选过程中快速鉴定阳性克隆。此外，载体上还应具备易于整合到宿主染色体或质粒中的结构，以便于进行基因编辑和改造。综合考虑这些因素，可以构建一个既满足表达需求，又易于操作和改造的猪干扰素α表达载体。

2.原核表达载体的构建

(1)原核表达载体的构建首先需要设计合成猪干扰素α的编码序列，通常采用PCR技术从猪细胞中扩增目的基因。以猪干扰素α为例，其基因长度约为1.5kb，包含7个外显子和6个内含子。在构建表达载体时，通常需要将编码序列上游的启动子区域（如T7启动子）和下游的终止子区域（如T7终止子）加入载体中，以确保基因能够在宿主菌中高效转录和翻译。例如，pET-28a载体就是一种常用的原核表达载体，其T7启动子能够驱动目的基因的高效表达。

(2)在构建过程中，将目的基因片段通过酶切连接到表达载体上。通常使用EcoRI和XhoI酶进行酶切，这两种酶能够产生黏性末端，有利于目的基因与载体的连接。连接反应后，通过琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行检测，以确保目的基因已成功连接到载体上。例如，通过电泳检测发现，目的基因与载体连接后形成的DNA片段大小应与预期相符。

(3)构建完成后，将表达载体转化到宿主菌中。以大肠杆菌为例，常用CaCl2法进行转化。转化后，在含有抗生素的培养基中培养转化菌，通过抗生素抗性筛选获得阳性克隆。阳性克隆经PCR和测序验证后，即可用于后续的表达实验。例如，在pET-28a载体上构建猪干扰素α的表达系统，经过验证，发现猪干扰素α在大肠杆菌中的表达量可达每毫克细胞蛋白10微克以上，且表达产物具有良好的生物活性。

3.表达载体的筛选与鉴定

(1)表达载体的筛选与鉴定是构建原核表达系统的重要环节。首先，通过在含有抗生素的培养基中培养转化菌，筛选出含有表达载体的克隆。例如，若使用pET-28a载体作为表达载体，则筛选出的克隆应表现出氨苄西林或卡那霉素的抗性。这一步骤有助于初步确定转化是否成功。

(2)接下来，对筛选出的阳性克隆进行PCR扩增，以验证目的基因是否已成功插入到表达载体中。PCR扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳分析，若观察到与预期大小相符的条带，则表明目的基因已正确插入到载体上。例如，对于猪干扰素α的表达载体，预期的PCR产物大小约为1.5kb。

(3)为了进一步确认表达载体是否具备表达活性，可进行蛋白质水平的鉴定。首先，收集转化菌的发酵上清液，通过SDS电泳分析蛋白条带。若观察到与猪干扰素α预期分子量相符的条带，则表明目的蛋白已在大肠杆菌中表达。随后，可通过Westernblotting进一步验证目的蛋白的特异性和纯度。例如，利用抗猪干扰素α的抗体进行Westernblotting，若检测到特异性条带，则可确认目的蛋白的表达。此外，还需对表达产物进行活性检测，以确保其具有生物学功能。

二、猪干扰素α原核表达条件优化

1.诱导剂的选择

(1)诱导剂的选择对于原核表达系统中蛋白的表达至关重要。常见的诱导剂包括IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、L-arabinose（L-阿拉伯糖）和citrate（柠檬酸盐）等。其中，IPTG是最常用的诱导剂，其诱导效率高，成本较低。研究表明，在pET表达系统中，IPTG的诱导浓度范围为0.1至1mM，最优浓度为0.5mM。例如，在一项针对大肠杆菌表达人源化干扰素的实验中，使用0.5mMIPTG诱导，蛋白表达水平可达每毫克细胞蛋白5微克。

(2)L-arabinose作为一种诱导剂，其优点在于其诱导过程