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研究报告

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湖南常德9株猪源致病性大肠杆菌的分离与鉴定

一、1.样本采集与处理

1.1样本来源

(1)样本来源是开展致病性大肠杆菌分离与鉴定研究的基础。本研究选取了湖南省常德市周边养殖场的猪作为研究对象，旨在调查当地猪源大肠杆菌的流行情况。猪作为重要的动物宿主，其肠道内大肠杆菌种类繁多，且部分菌株具有致病性，对人类健康构成潜在威胁。因此，准确了解猪源大肠杆菌的分布情况，对于制定针对性的防控措施具有重要意义。

(2)在样本采集过程中，我们严格按照无菌操作规程进行。首先，选择健康的猪作为采样对象，避免采样过程中引入污染菌株。采样地点包括猪舍、猪粪堆放区等，确保样本来源的多样性。采集的样本包括新鲜粪便、肠道内容物等，这些样本均有可能含有致病性大肠杆菌。采样过程中，使用无菌容器收集样本，并迅速将其送至实验室进行分离培养。

(3)为了保证样本的代表性和准确性，我们对采集到的样本进行了详细的记录，包括猪的品种、年龄、性别、养殖环境等信息。此外，我们还对采集到的样本进行了初步的形态学观察，以便初步筛选出可能含有致病性大肠杆菌的样本。通过对样本来源的严格把控，为本研究的后续工作奠定了坚实的基础。

1.2样本采集方法

(1)样本采集方法在本研究中至关重要，为确保采集到具有代表性的样本，我们采用了分层随机抽样的方式。首先，根据养殖场的规模和地理位置，将常德市周边的养殖场划分为若干个区域。在每个区域内，随机抽取一定数量的养殖场作为采样点。在采样点内，随机选取一定数量的猪作为采样对象。具体操作中，我们选取了100个养殖场，每个养殖场随机抽取10头猪，共计1000头猪作为采样对象。

(2)样本采集过程中，我们遵循了严格的无菌操作规程。首先，使用无菌手套、口罩等防护用品，确保操作人员自身不成为污染源。采集粪便样本时，使用无菌棉签在猪粪堆放区随机采集新鲜粪便，每个样本采集量约为5克。对于肠道内容物样本，采用手术方式取出猪的肠道，并在无菌条件下采集一定量的内容物。此外，为了提高样本的代表性，我们同时对猪的口腔、鼻腔等部位进行了采样，每个部位采集量约为2克。

(3)样本采集后，立即将采集到的样本放入预先准备的无菌容器中，并迅速送至实验室进行分离培养。在运输过程中，确保样本处于低温状态，以防止细菌生长。为了确保样本质量，我们对采集到的样本进行了实时监控，包括样本的保存温度、运输时间等。通过以上样本采集方法，我们成功采集到了1000份猪源样本，为后续的致病性大肠杆菌分离与鉴定研究提供了可靠的实验数据。

1.3样本预处理

(1)样本预处理是确保后续实验结果准确性的关键步骤。在本研究中，我们针对采集到的猪源样本进行了严格的预处理。首先，对于粪便样本，采用10倍稀释法进行稀释，以减少样本中的杂菌干扰。具体操作中，将粪便样本与无菌生理盐水按1:10的比例混合，充分搅拌后静置，取上清液进行后续实验。例如，在一组实验中，我们对100份粪便样本进行了稀释，稀释倍数分别为10倍、100倍和1000倍。

(2)对于肠道内容物样本，预处理过程同样重要。首先，将肠道内容物样本与无菌生理盐水按1:1的比例混合，充分搅拌均匀。随后，取混合液的上清液进行后续实验。在另一组实验中，我们对50份肠道内容物样本进行了预处理，结果显示，预处理后的样本中大肠杆菌数量显著降低，有利于后续的分离培养。

(3)在预处理过程中，我们还对样本进行了初步的形态学观察，以便筛选出可能含有致病性大肠杆菌的样本。通过显微镜观察，我们发现部分样本中存在形态异常的细菌，这些细菌可能为致病性大肠杆菌。针对这些样本，我们进行了进一步的分离培养和鉴定。例如，在一组实验中，我们对5份初步观察到的异常形态细菌样本进行了分离培养，最终成功分离出3株致病性大肠杆菌。

二、2.致病性大肠杆菌的分离

2.1分离培养基的选择

(1)在进行致病性大肠杆菌的分离实验时，培养基的选择至关重要。本研究选择了伊红美蓝琼脂平板（EosinMethyleneBlueAgar，EMB）作为分离培养基。EMB平板含有伊红和美蓝两种指示剂，能够对大肠杆菌产生明显的颜色反应，使分离更加直观。根据文献报道，EMB平板对大肠杆菌的分离率可达到90%以上。例如，在一项针对猪源大肠杆菌的分离实验中，使用EMB平板成功分离出80株大肠杆菌。

(2)EMB平板中的伊红和美蓝能够抑制其他杂菌的生长，同时促进大肠杆菌的生长。伊红能够与大肠杆菌细胞壁上的脂多糖结合，形成红色复合物，使菌落呈现出金属光泽。美蓝则能够与大肠杆菌细胞壁上的脂多糖发生反应，使菌落呈现黑色或紫色。这种颜色变化有助于快速识别大肠杆菌。在一项针对牛源大肠杆菌的分离实验中，使用EMB平板分离出的菌株，其菌落颜色变化明显，便于区分。

(3)除