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研究报告

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餐饮及相关食品中病原菌活菌多重实时荧光PCR检测方法的研究与开发

一、引言

1.1研究背景

(1)随着全球人口的增长和城市化进程的加快，食品安全问题日益凸显。餐饮及相关食品作为人们日常生活的重要组成部分，其卫生质量直接关系到公众健康。近年来，食品安全事件频发，其中病原菌污染是导致食源性疾病的主要原因之一。病原菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等，能在食品中存活、繁殖，并通过食用传播给人类，引发腹泻、食物中毒等健康问题。

(2)传统的病原菌检测方法如培养法、免疫学检测等，存在检测周期长、灵敏度低、操作复杂等缺点，难以满足快速、准确、高效的需求。随着分子生物学技术的快速发展，实时荧光PCR技术因其高灵敏度、高特异性和快速检测等优点，逐渐成为病原菌检测的首选方法。然而，目前市场上的多重实时荧光PCR检测方法大多针对单一病原菌，难以满足复杂食品样品中多种病原菌的检测需求。

(3)为了解决上述问题，开发一种针对餐饮及相关食品中病原菌活菌的多重实时荧光PCR检测方法具有重要意义。这种方法不仅可以提高检测的准确性和效率，还可以实现多种病原菌的同时检测，为食品安全监管提供有力技术支持。此外，该方法的研发和应用将有助于提高公众对食品安全问题的认识，促进食品安全产业的发展。因此，本研究旨在开发一种高效、准确、操作简便的多重实时荧光PCR检测方法，为保障公众饮食安全提供技术支持。

1.2餐饮及相关食品病原菌的危害

(1)餐饮及相关食品中的病原菌污染是全球公共卫生问题之一，据统计，每年约有5亿至10亿人因食源性疾病而患病，其中约12万人因此死亡。以沙门氏菌为例，它是最常见的食源性病原菌之一，每年导致约1200万例感染。2011年，美国爆发了由福氏沙门氏菌引起的食源性疾病暴发，涉及47个州，导致1.4万人感染，7人死亡。

(2)金黄色葡萄球菌是另一种常见的食源性病原菌，其产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因之一。2018年，美国疾病控制与预防中心（CDC）报告称，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例占所有食源性疾病病例的10%以上。在2015年，一起由生牛肉引起的金黄色葡萄球菌食物中毒事件导致35人住院。

(3)大肠杆菌O157:H7是另一种危险的食源性病原菌，它能够引起严重的出血性大肠炎和溶血性尿毒综合征。根据CDC的数据，美国每年约有1.2万例由大肠杆菌O157:H7引起的病例，其中约300例需要住院治疗。2011年，一起由生菜引起的O157:H7食物中毒事件导致147人感染，其中3人死亡。这些数据和案例表明，病原菌污染对公众健康构成了严重威胁，亟需有效的检测和控制措施。

1.3现有检测方法的局限性

(1)传统培养法是食品安全检测中最常用的方法之一，但其检测周期长，通常需要3-7天才能得到结果。例如，沙门氏菌的培养检测通常需要5-7天，金黄色葡萄球菌的培养检测则需要3-5天。这种延长的检测时间导致在食品召回和疾病控制方面反应迟缓，无法及时阻止病原菌的传播。在2013年，美国发生的一起由沙拉引起的沙门氏菌感染事件中，由于检测延误，导致超过200人感染。

(2)免疫学检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验等，虽然比培养法快，但通常只能检测单一病原体，对于多重病原体的检测效率低下。此外，这些方法依赖于抗原和抗体的特异性结合，如果抗原或抗体存在交叉反应，可能会产生假阳性或假阴性结果。例如，2011年，英国发生的一起由猪肉引起的旋毛虫感染事件中，由于ELISA检测的局限性，导致早期未能准确识别病原体。

(3)实时荧光PCR技术因其快速、高灵敏度和高特异性而受到青睐，但现有的实时荧光PCR检测方法往往存在以下局限性：首先，引物和探针的设计复杂，需要针对不同的病原体进行单独设计，增加了成本和时间。其次，多重PCR检测容易受到抑制效应的影响，当样本中某一病原体的浓度远高于其他病原体时，可能会导致其他病原体的检测结果不准确。最后，由于食品安全检测样品的复杂性，需要复杂的样品前处理步骤，这些步骤可能引入人为误差，影响检测结果的可靠性。例如，2017年，美国一家大型食品加工厂因实时荧光PCR检测方法的不准确，导致部分产品被错误地标记为安全，最终引发消费者投诉。

二、病原菌活菌多重实时荧光PCR检测方法的基本原理

2.1实时荧光PCR技术简介

(1)实时荧光PCR技术（Real-timeQuantitativePCR，RT-qPCR）是一种基于PCR原理的分子生物学检测方法，通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号变化，实现对靶标DNA或RNA的定量检测。与传统PCR相比，RT-qPCR具有快速、灵敏、特异等优点。据统计，RT-qPCR的检测灵敏度可达到单个靶标分子的水平，是传统PC