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研究报告

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等温扩增技术在食源性致病菌检测中的研究进展

一、等温扩增技术概述

1.等温扩增技术的原理

等温扩增技术（isothermalamplification，IA）是一种在恒定温度下进行的DNA扩增方法，无需使用传统PCR所需的温度循环。其原理是利用特定的DNA结合酶，如DNA聚合酶、DNA结合蛋白等，在恒温条件下直接催化DNA的扩增。例如，环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）中，LAMP引物包含两个特异性引物和一个内参引物，以及一种特殊的DNA聚合酶BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）。该酶具有高热稳定性，能够在60-65℃的恒温条件下进行DNA的扩增。

在LAMP反应中，当引物与靶标DNA结合后，BstDNA聚合酶会从引物的3端开始延伸，形成一条新的DNA链。由于LAMP引物的设计具有特异性，因此只有与靶标DNA完全匹配的引物才能进行扩增，从而保证了检测的特异性。据统计，LAMP反应在30分钟内即可完成，其扩增效率高达每分钟1.5倍，远高于传统PCR的扩增效率。

以食源性致病菌大肠杆菌O157:H7的检测为例，LAMP技术已被广泛应用于该菌的快速检测。研究显示，通过优化LAMP反应体系，可以在短短的30分钟内对大肠杆菌O157:H7进行定量检测，检测限可达10个CFU/mL。此外，LAMP技术还具有操作简便、成本较低、对仪器设备要求不高等优点，使其在食品安全检测领域具有广阔的应用前景。在实际应用中，LAMP技术已被成功应用于多种食品样品中大肠杆菌O157:H7的检测，如生肉、熟肉、蔬菜、水果等，为食品安全提供了有力保障。

2.等温扩增技术的分类

(1)等温扩增技术根据其作用机制和使用的酶类可以分为多种类型。其中，最常见的是基于DNA聚合酶的扩增技术，如环介导等温扩增（LAMP）、重组聚合酶扩增（RPA）和等温核酸扩增（iTA）。这些技术利用特定的DNA聚合酶在恒温条件下进行DNA的复制。

(2)环介导等温扩增（LAMP）是其中一种应用广泛的技术，它利用四种特异性引物和一种特殊的DNA聚合酶BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）来识别靶标DNA序列，并在恒温条件下进行高效的DNA扩增。LAMP具有快速、特异、灵敏等优点，被广泛应用于病原微生物的检测。

(3)重组聚合酶扩增（RPA）技术则是另一种等温扩增方法，它使用一种重组的DNA聚合酶，如重组T7聚合酶，来在恒温条件下进行DNA的扩增。RPA技术具有快速、简便、无需PCR仪器等优点，特别适用于现场快速检测。此外，还有基于RNA的等温扩增技术，如重组RNA聚合酶扩增（RT-LAMP），适用于RNA病毒的检测。这些技术的分类有助于根据不同的检测需求选择合适的方法。

3.等温扩增技术的优势

(1)等温扩增技术的一大优势是其在恒温条件下即可进行DNA扩增，无需传统PCR的多次温度循环。这种特性使得等温扩增技术在时间效率上具有显著优势。例如，环介导等温扩增技术（LAMP）在30分钟内即可完成靶标DNA的扩增，远快于传统PCR的60分钟以上。在实际应用中，LAMP技术在检测食源性致病菌如大肠杆菌O157:H7时，可在短短30分钟内获得结果，极大地缩短了检测时间。

(2)等温扩增技术的另一大优势是其高特异性和灵敏度。通过精心设计的引物，等温扩增技术能够准确识别特定的靶标序列，从而降低了假阳性和假阴性的发生。据统计，LAMP技术在检测大肠杆菌O157:H7时的灵敏度可达到10个CFU/mL，而传统PCR的灵敏度通常在100个CFU/mL以上。这种高灵敏度对于病原微生物的早期检测和监控具有重要意义。

(3)等温扩增技术操作简便，无需复杂的仪器设备和专业技能。LAMP技术的反应体系相对简单，通常只需要引物、DNA模板、核酸提取试剂和一种特殊的DNA聚合酶。这种简便性使得等温扩增技术可以广泛应用于实验室、现场检测以及非专业人员操作的场景。例如，在非洲猪瘟的检测中，LAMP技术已被证明是一种简单、快速且可靠的检测方法，有助于早期诊断和防控。

二、食源性致病菌的种类及检测现状

1.食源性致病菌的类型

(1)食源性致病菌是指通过食物传播，能够引起人类疾病的细菌。这些细菌种类繁多，其中一些最常见的包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌等。沙门氏菌是全球范围内最常见的食源性致病菌之一，据统计，每年有约1亿人受到沙门氏菌感染。例如，2018年美国因沙门氏菌感染导致的病例高达1.35万例。

(2)大肠杆菌（Escherichiacoli）是另一类重要的食源性致病菌，尤其是O157:H7血清型的大肠杆菌。这种菌株能够