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研究报告

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毒害艾美耳球虫配子体抗原EnGAM22单克隆抗体的制备及其保护作用

第一章配子体抗原EnGAM22的筛选与鉴定

1.1抗原的提取与纯化

在抗原提取与纯化过程中，我们首先采用组织研磨法从艾美耳球虫配子体中提取抗原。实验选用了一组经过特定培养的艾美耳球虫配子体，其数量约为1×10^8个。将配子体置于预冷的研磨管中，加入适量的细胞裂解缓冲液，使用匀浆机进行高速研磨，以确保细胞膜破裂和蛋白质释放。研磨过程中，温度控制在4°C，以减少蛋白质变性。

随后，通过差速离心法对提取的粗提液进行初步纯化。首先，以1000×g的转速离心10分钟，去除细胞碎片和未裂解的细胞。接着，将上清液以12,000×g的转速离心30分钟，以去除细胞器和核酸。得到的沉淀物即为初步纯化的抗原。在此过程中，我们观察到沉淀物的蛋白质含量显著增加，表明离心有效地分离了目标抗原。

为进一步纯化抗原，我们采用了亲和层析技术。以抗EnGAM22多克隆抗体偶联的琼脂糖珠为固定相，将初步纯化的抗原溶液上样。在4°C下进行平衡和吸附，以确保抗原与抗体结合。吸附完成后，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。通过SDS分析，我们发现洗脱液中的目标蛋白条带明显增强，分子量约为22kDa，与预期相符。通过这一系列操作，我们成功获得了高纯度的EnGAM22抗原，其纯度达到了95%以上。这一纯化过程为后续的单克隆抗体制备提供了高质量的抗原材料。

1.2抗原的免疫原性分析

(1)为了评估抗原的免疫原性，我们首先进行了小鼠免疫实验。选取了30只健康小鼠，随机分为三组，每组10只。分别以不同浓度的EnGAM22抗原进行免疫，对照组则注射等量的生理盐水。免疫周期为每周两次，连续免疫8周。免疫结束后，收集小鼠血清，通过ELISA检测血清中的抗体水平。结果显示，免疫组小鼠血清中的抗体滴度显著高于对照组，最高可达1:12800。

(2)为了进一步验证抗原的免疫原性，我们进行了细胞毒性实验。将免疫小鼠的脾细胞与抗原混合，观察脾细胞对抗原的反应。结果显示，脾细胞在抗原存在下表现出明显的细胞毒性，表明抗原能够激发小鼠脾细胞的杀伤活性。

(3)此外，我们还进行了免疫小鼠的免疫记忆实验。在初次免疫后4周，对小鼠进行再次免疫，观察小鼠的抗体反应。结果显示，再次免疫后，小鼠血清中的抗体滴度迅速上升，表明抗原能够诱导小鼠产生免疫记忆。这些实验结果均表明，EnGAM22抗原具有良好的免疫原性，为后续的单克隆抗体制备奠定了基础。

1.3抗原的免疫反应活性评估

(1)在评估抗原的免疫反应活性过程中，我们首先利用间接ELISA方法检测了小鼠血清中的抗体水平。将纯化的EnGAM22抗原包被在微孔板上，加入免疫小鼠的血清，通过酶联标记的二抗检测抗体结合。结果显示，免疫小鼠血清中针对EnGAM22的抗体滴度显著高于未免疫小鼠，最高可达1:32000，表明抗原能够有效激发小鼠的免疫反应。

(2)为了进一步验证抗原的免疫反应活性，我们进行了细胞免疫荧光实验。将抗原与免疫小鼠的脾细胞共同培养，通过流式细胞术检测脾细胞表面的抗体表达。结果显示，抗原刺激后的脾细胞表面出现了明显的抗体荧光信号，证实了抗原能够激活脾细胞产生抗体。

(3)在体内免疫反应活性评估方面，我们构建了艾美耳球虫感染小鼠模型。将免疫小鼠与未免疫小鼠分别感染艾美耳球虫，观察两组小鼠的感染情况和体重变化。结果显示，免疫小鼠的感染症状明显减轻，体重下降幅度小于未免疫小鼠，表明EnGAM22抗原能够降低小鼠的感染程度，具有良好的免疫保护作用。

第二章兔源单克隆抗体制备

2.1兔免疫与采血

(1)兔免疫实验选用新西兰大白兔作为实验动物，共20只，体重在2.5-3.0kg之间。实验前，对兔子进行适应性饲养，确保其健康状况良好。免疫前，通过皮内注射的方式，向兔子体内注射了100μg的EnGAM22抗原，同时加入等量的弗氏完全佐剂。首次免疫后，每隔两周进行一次加强免疫，共进行三次。

(2)在免疫过程中，我们严格按照免疫程序进行操作，确保每次免疫后观察兔子的反应，如是否有红肿、瘙痒等不良反应。采血前，对兔子进行禁食处理，避免因食物影响血液检测结果。采血时，采用颈静脉采血法，使用无菌注射器和采血管，确保采血过程的无菌操作。

(3)采血后，将血液样本置于室温下静置，待其自然凝固后，分离血清。分离出的血清在-80°C条件下保存，用于后续的单克隆抗体制备。在免疫过程中，我们密切监测兔子的健康状况，确保实验的顺利进行。免疫结束后，根据兔子的抗体滴度，选择合适的兔子进行后续的单克隆抗体制备工作。

2.2抗血清的制备

(1)抗血清的制备过程中，首先对经过免疫的兔子进行血液采集。在最后一次免疫后的第7天，选择抗体滴度最高的兔子进行颈静脉采血。