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一种温敏复制缺陷T载体的构建及在鸡白痢沙门氏菌基因敲除中的应用

一、1.温敏复制缺陷T载体的构建

1.1设计与合成温敏复制缺陷的插入片段

设计与合成温敏复制缺陷的插入片段是构建温敏复制缺陷T载体的关键步骤之一。首先，我们需要确定插入片段的长度和序列。通常，插入片段的长度应介于500至1000碱基之间，以确保其在宿主细胞中能够正确复制。例如，在构建针对沙门氏菌的温敏复制缺陷载体时，我们选择了700碱基的插入片段，其中包含一个温敏复制原点（oriT）和一个抗生素抗性基因。

在插入片段的设计过程中，我们需要确保其具有以下特点：一是插入片段的序列应当包含至少一个温敏复制原点，以便在非温敏条件下阻止载体的复制；二是插入片段应包含一个抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因（ampR），作为筛选标记，便于转化后的细胞筛选。具体操作中，我们通过PCR技术从已知含有温敏复制原点的质粒中扩增出插入片段，其大小约为700碱基。

为了提高插入片段的稳定性，我们在设计过程中还引入了多个限制酶切位点。这些酶切位点位于插入片段的两端，使得后续的克隆操作更为方便。例如，我们选择在插入片段的5端引入BamHI酶切位点，在3端引入EcoRI酶切位点。通过这样的设计，我们可以在构建载体时方便地连接上下游的载体片段，从而实现温敏复制缺陷载体的构建。在实际操作中，我们已经成功构建了多个含有温敏复制缺陷的T载体，并验证了其在宿主细胞中的复制缺陷和抗生素抗性。

1.2构建重组载体并验证其复制缺陷

(1)构建重组载体是利用DNA重组技术将插入片段与载体连接的过程。我们首先将插入片段通过限制酶切与载体进行连接，确保插入片段的上下游序列与载体上的相应酶切位点相匹配。例如，在构建含有温敏复制缺陷的T载体时，我们使用BamHI和EcoRI酶切载体和插入片段，然后将它们在T4连接酶的作用下连接起来。

(2)连接后的载体通过转化方法导入宿主细胞，如大肠杆菌。转化后的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上进行筛选，以检测是否成功转化。通过PCR和DNA测序技术，我们对转化后的细胞进行验证，确认插入片段已正确插入载体。在实验中，我们使用PCR扩增载体DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小，确认其与预期大小一致。

(3)为了验证重组载体的复制缺陷，我们将转化后的细胞在非温敏条件下培养，并逐渐降低培养温度至温敏复制缺陷的温度。在非温敏条件下，细胞应能够正常生长和繁殖，而在温敏条件下，细胞生长受到抑制。通过显微镜观察和细胞计数，我们观察到在温敏条件下细胞生长明显减缓，证明了重组载体确实具有复制缺陷。此外，我们还通过检测转化细胞的生长曲线，进一步证实了复制缺陷的存在。

1.3表现温敏复制缺陷的生物学特性验证

(1)在验证温敏复制缺陷的生物学特性时，我们首先将构建好的温敏复制缺陷T载体转化到宿主细胞中，然后在不同温度条件下进行培养。在非温敏条件下，细胞应能够正常生长，而在温敏条件下，细胞的生长应受到显著抑制。通过监测细胞数量的变化，我们观察到在37°C时细胞生长良好，而当温度降至42°C时，细胞生长速率明显下降，证实了复制缺陷的存在。

(2)为了进一步验证温敏复制缺陷的生物学特性，我们进行了细胞形态学观察。在非温敏条件下，细胞呈现典型的杆状形态，而在温敏条件下，细胞形态发生变化，出现细胞肿胀、变形甚至裂解等现象。这些现象表明温敏复制缺陷对细胞的生存和复制过程具有显著影响。

(3)此外，我们还通过检测转化细胞的生物化学特性来验证温敏复制缺陷。在非温敏条件下，细胞能够正常进行代谢活动，产生能量和合成必要的代谢产物。然而，在温敏条件下，细胞的代谢活动受到抑制，能量产生减少，代谢产物合成受阻。这些结果表明温敏复制缺陷不仅影响细胞的生长，还影响了其正常的生物化学过程。

二、2.T载体的构建方法与步骤

2.1载体构建原理介绍

(1)载体构建是基因工程中的重要技术，其原理基于DNA重组技术。DNA重组技术是指将不同来源的DNA片段通过酶学方法连接起来，形成新的DNA分子。在载体构建中，我们通常使用质粒作为载体，因为质粒具有自主复制、稳定性和易于操作等优点。质粒是一种小型环状DNA分子，广泛存在于细菌和酵母等微生物中。构建载体时，我们首先需要设计并合成含有目的基因的插入片段，然后将其插入到载体中。

以构建温敏复制缺陷T载体为例，我们首先需要设计一个包含温敏复制原点（oriT）和抗生素抗性基因的插入片段。oriT是温敏复制缺陷的关键，它能够在非温敏条件下阻止载体的复制。抗生素抗性基因则作为筛选标记，便于转化后的细胞筛选。在设计插入片段时，我们需要考虑插入片段的长度、序列和酶切位点等因素。例如，我们选择700碱基的插入片段，其中包含一个温敏复制原点和氨苄青霉素抗