重组人表皮生长因子在毕赤酵母x33中的构建、表达和纯化.docVIP

重组人表皮生长因子在毕赤酵母x33中的构建、表达和纯化

重组人表皮生长因子在毕赤酵母X33中的构建、表达和纯化流程

一、构建

1.获取目的基因

-人表皮生长因子（hEGF）基因可以通过以下方法获取。首先从人源细胞（如肝脏细胞等，这些细胞天然表达hEGF相关基因）中提取总RNA，然后通过逆转录酶的作用合成cDNA。以cDNA为模板，设计特异性引物，引物中通常要引入合适的限制性内切酶位点（如EcoRI、XhoI等），用于后续与载体连接。通过PCR技术扩增出hEGF基因片段。

-也可以通过化学合成的方法直接合成hEGF基因，根据已知的hEGF基因序列，交由专业的生物公司合成带有合适酶切位点的基因片段。

2.选择和处理载体

-常用的毕赤酵母表达载体如pPIC9K等。将载体用相应的限制性内切酶进行酶切，酶切后的载体通过凝胶电泳回收目的片段，去除杂质和可能的载体自身环化产物，保证载体的纯度和活性。

3.连接目的基因与载体

-将经过酶切的hEGF基因片段与处理好的载体按照一定的摩尔比（通常为3:1-10:1）混合，加入T4DNA连接酶和相应的连接缓冲液，在合适的温度（如16℃过夜或室温连接数小时）下进行连接反应，使hEGF基因插入到载体中，形成重组表达载体。

4.转化大肠杆菌

-将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中（如DH5α菌株）。将连接产物与感受态细胞混合，冰浴一段时间后进行热激处理（如42℃，90秒），然后迅速放回冰浴。加入无抗生素的LB培养基，37℃振荡培养一段时间（如1小时），使大肠杆菌恢复生长并表达抗性基因。

-将培养物涂布在含有相应抗生素（如氨苄青霉素，根据载体上携带的抗性基因选择）的LB平板上，37℃培养过夜，筛选出含有重组表达载体的大肠杆菌菌落。

5.重组表达载体的鉴定

-挑取平板上的单菌落，接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒DNA，通过限制性内切酶酶切分析，观察酶切片段的大小是否符合预期，判断目的基因是否正确插入载体。也可以进行PCR鉴定，以提取的质粒为模板，用hEGF基因特异性引物进行PCR扩增，看是否能得到预期大小的条带。此外，还可以进行测序分析，将重组质粒送测序公司测序，与已知的hEGF基因序列进行比对，确保基因序列正确，没有突变。

二、表达

1.转化毕赤酵母X33

-首先制备毕赤酵母X33感受态细胞。将毕赤酵母X33接种到合适的液体培养基（如YPD培养基）中，培养至对数生长期。收集细胞，用冰冷的无菌水、山梨醇等溶液依次洗涤细胞，制成感受态细胞悬液。

-将经过鉴定正确的重组表达载体用限制性内切酶线性化（如用SalI酶切pPIC9K载体上特定的位点），线性化后的载体更有利于整合到毕赤酵母基因组中。将线性化的重组表达载体与毕赤酵母X33感受态细胞混合，通过电转化（如1.5kV，5ms等参数）或化学转化（如采用LiCl法）等方法将载体导入毕赤酵母细胞中。

-转化后的细胞涂布在含有相应抗生素（如博来霉素，根据载体上的抗性标记）的筛选平板（如MD平板或MM平板，用于筛选不同营养缺陷型的转化子）上，30℃培养2-3天，筛选出转化子。

2.筛选高表达菌株

-从平板上挑取多个转化子，接种到小量的液体培养基（如BMGY培养基）中，30℃振荡培养至对数生长期。然后将细胞转移到含有甲醇的诱导培养基（如BMMY培养基，甲醇作为诱导剂诱导重组蛋白表达）中，继续培养一段时间（如3-5天），期间每隔一定时间（如12小时）补加适量的甲醇。

-收集培养上清，通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）等方法分析蛋白表达情况，初步筛选出表达量较高的菌株。对于表达量较高的菌株，可以进一步进行摇瓶发酵优化，调整培养条件（如温度、pH值、甲醇添加量和添加时间等），以提高重组人表皮生长因子的表达量。

3.发酵罐培养

-将筛选出的高表达菌株接种到种子培养基中，培养至合适的菌密度。然后将种子液接入发酵罐中，发酵罐中使用合适的发酵培养基（如含有丰富营养成分的复杂培养基）。在发酵过程中，严格控制发酵参数，如温度（通常30℃左右）、pH值（如6.0-6.5）、溶氧（通过通气和搅拌控制）等。

-发酵初期进行甘油补料培养，使菌体大量生长。当甘油消耗完后，切换到甲醇诱导阶段，通过流加甲醇来诱导重组人表皮生长因子的表达。在整个发酵过程中，持续监测菌体生长情况（如通过测定OD600值）和蛋白表达情况（如定期取样进行SDS-PAGE分析）。

三、纯化

1.收集发酵液并预处理

-发酵结束后，收集发酵液。首先通过离心（如5000-10000rpm，