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湖羊瘤胃未培养微生物中木聚糖酶基因的克隆和表达

摘要

本研究旨在从湖羊瘤胃未培养微生物中克隆木聚糖酶基因并实现其表达。通过构建瘤胃微生物宏基因组文库，筛选出含木聚糖酶基因的阳性克隆，经测序分析得到木聚糖酶基因序列。将该基因连接到表达载体并转化至宿主菌，诱导表达后对重组木聚糖酶进行活性测定。成功克隆到多个木聚糖酶基因，其中UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2和UMXYL2-6-1等基因在大肠杆菌中实现表达，重组酶表现出木聚糖酶活性。本研究为木聚糖酶的开发和应用提供了新的基因资源，有助于深入理解湖羊瘤胃微生物对木质纤维素的降解机制。

关键词

湖羊；瘤胃未培养微生物；木聚糖酶基因；克隆；表达

一、引言

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于农作物秸秆、木材等木质纤维素类物质中。木聚糖酶能够将木聚糖降解为低聚木糖和木糖，在饲料、食品、造纸、生物能源等领域具有重要的应用价值。反刍动物瘤胃是一个复杂的微生物生态系统，其中的微生物能够产生多种酶类，协同降解木质纤维素。湖羊作为我国优良的地方绵羊品种，对粗饲料具有较强的利用能力，其瘤胃微生物中蕴含着丰富的木聚糖酶基因资源。然而，传统的微生物培养方法只能分离培养少数微生物，大部分瘤胃微生物处于未培养状态，这些未培养微生物中可能存在具有独特性质和功能的木聚糖酶基因。宏基因组学技术为挖掘未培养微生物基因资源提供了有力手段，通过构建瘤胃微生物宏基因组文库，可以直接从环境样品中克隆和筛选目的基因。本研究利用宏基因组学技术，从湖羊瘤胃未培养微生物中克隆木聚糖酶基因，并对其在大肠杆菌中的表达进行研究，以期为木聚糖酶的开发和应用提供新的基因资源，同时也为深入了解湖羊瘤胃微生物对木质纤维素的降解机制奠定基础。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1瘤胃内容物采集

选取健康成年湖羊，采用口腔瘘管法采集瘤胃内容物，立即放入液氮中速冻，带回实验室后保存于-80℃冰箱备用。

2.1.2主要试剂和仪器

DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司；蛋白Marker、IPTG、X-Gal等购自Sigma公司；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞为本实验室保存；pET-28a（+）表达载体购自Novagen公司。PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、恒温摇床、高速冷冻离心机等为常见实验室仪器。

2.2实验方法

2.2.1瘤胃微生物总DNA的提取

采用CTAB法结合蛋白酶K处理提取瘤胃微生物总DNA。具体步骤如下：取1g瘤胃内容物，加入1mL裂解缓冲液（100mMTris-HCl，pH8.0；100mMEDTA，pH8.0；100mMNaCl；1%SDS）和20μL蛋白酶K（20mg/mL），37℃水浴振荡孵育1h；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），轻轻颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清；重复抽提一次；向上清中加入1/10体积的3MNaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min；12000r/min离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀两次，晾干后溶于适量TE缓冲液中。通过琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪检测DNA的质量和浓度。

2.2.2宏基因组文库的构建

将提取的瘤胃微生物总DNA用限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收3-8kb的DNA片段。将回收的DNA片段与经BamHI酶切并去磷酸化的pUC19载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mM）和X-Gal（40μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜。随机挑取白色菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h，提取质粒进行酶切鉴定，构建宏基因组文库。

2.2.3木聚糖酶基因的筛选

以木聚糖为唯一碳源，配制筛选培养基（1%木聚糖，0.5%蛋白胨，0.3%酵母提取物，0.5%NaCl，0.1%K2HPO4，0.05%MgSO4?7H2O，1.5%琼脂，pH7.0）。将宏基因组文库的菌液均匀涂布于筛选培养基平板上，37℃培养2-3d，观察菌落周围是否出现透明圈。挑取有透明圈的菌落，进行二次筛选和验证。对阳性克隆进行质粒提取，PCR扩增插入片段，测序分析。

2.2.4木聚糖酶基因的克隆

根据测序结