PikoReal使用培训致病菌检测讲课文档.pptVIP

绝对定量和熔解曲线分析选中Cq,点击Absolute,添加绝对定量标准曲线第61页，共64页。单重和多重荧光定量PCR单通道（单色）：一个PCR管里只做一个基因定量（多用SybrGreen）双通道（两色）：一个PCR管里做两个基因的定量多通道（多色）：一个PCR管里做三个以上基因定量常用FAMHEX第29页，共64页。PikoReal功能简介第30页，共64页。研发生产中心：位于芬兰Espoo第31页，共64页。光源:5xLED寿命长，终身无需更换，为qPCR实验提供持续，稳定的激发信号无需使用ROX染料进行光强校正探测器：CCD相机能同时快速收集整板多重荧光信号数据高灵敏度PCR模块：96孔半导体PCRPikoREAL的硬件系统:第32页，共64页。功能：绝对定量双探针法HRM法相对定量基因型分析熔解曲线分析选配模块第33页，共64页。五通道四色：激发波长(nm)发射波长(nm)预校正的染料475–500520–550FAM,SYBRGreen515–535557–590HEX,YakimaYellow570–590615–650ROX,TexasRed600–640666–740Cy5475–500520–590单色通道，HRM通道一个反应管里最多可同时检测4种不同的致病菌核酸第34页，共64页。仪器特点：1、硬件组合优越，设计创新2、更加适合5-10ul小反应体系，成倍节省实验成本3、小巧、快速、稳定、安静无声第35页，共64页。致病菌检测实验操作及结果分析第36页，共64页。检测流程25g或25ml样品＋225ml预增菌培养液，混匀，适宜的温度下培养24小时取1ml培养液，加入裂解液，裂解细菌，释放核酸（45min）配制标准品，PCR反应液，加样（30min）定量PCR反应，查看并分析结果（1.5h）阴性：出结果报告阳性：继续用培养法验证结果两天内可出结果第37页，共64页。检测项目GB中的名称OXOID的英文名称OXOID的中文名称OXOID货号规格沙门氏菌缓冲蛋白胨水（BPW）BufferPeptoneWater(ISO)缓冲蛋白胨水(ISO)CM1049B500gCM1049R2.5kgCM1049T5kg金葡菌10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤TryptoneSoyaBroth（Soybean

CaseinDigestMediumUSP）胰蛋白胨大豆肉汤（美国药典中大豆酪蛋白消化物培养基）CM0129B500gCM0129R2.5kgCM0129T5kg大肠埃希氏菌O157：H7/NM改良EC肉汤ECBROTH(ReducedBileSalts)EC肉汤（减少胆盐）CM0990B500g志贺氏菌GN增菌液GNBrothGN增菌液R453511100gR453512500gR4535142.5kgOXOID常用预增菌培养液：赛默飞咨询热线：800－810－51181、预增菌－按说明书操作第38页，共64页。2、细菌裂解，配制反应液及上样1）细菌裂解：获得待测样品。2）配制标准品：阴性对照样品，阳性对照样品（4个浓度）3）按检测样品量计算所需反应液的量4）配制所需反应液，混合均匀5）把反应液加入反应板，并分别在相应的孔加入阴性对照样品、阳性对照样品，待测样品。以下操作均按照检测试剂盒操作说明书进行：第39页，共64页。检测试剂开放，可选择各国产及进口厂家试剂盒第40页，共64页。以金黄色葡萄球菌的检测为例1、样品预增菌25g或25ml样品＋10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤37度，24小时金黄色葡萄球菌：StaphylococcusAureus(SA)第41页，共64页。以金黄色葡萄球菌的检测为例2、细菌裂解，样品制备A、取1ml培养液，13000rpm离心2分钟B、去上清液，加入100ulDNA提取液充分混匀C、沸水浴加热10分钟（误差不超过1分钟）D、13000rmp离心5分钟，上清液备用（样品）试剂盒：Liferiver金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（荧光法）生产商：上海之江生物科技货号：DD－0041－02第42页，共64页。3、梯度标准品配制A、内部对照：取内部对照品4ul，加36ul水，震荡混匀后，3000rmp离心1