大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计.pdfVIP

大肠杆菌基因组DNA的提取

一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。

1、试验原理

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在十二烷基硫酸钠

(SDS)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽

提分别蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质

的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉

蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四

乙酸二钠)存在的状况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体

系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA

分别；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地

分别出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最终用无水乙醇沉淀DNAo

为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB(十

六烷基三乙基溟化钱)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成

复合物，在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓

度到肯定的程度(0.3mol/LNaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可

将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最终通过乙醇或异丙醛

沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

2、试验试剂与仪器

1)试验材料：大肠杆菌

2)试验试剂:

LB液体培育基，TE溶液，10%SDS,蛋白酶K,5mol/L

NaCl,CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊彝，异丙噂，70%乙醇

3）试验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅

3、溶液配制

1）LB液体培育基：细菌培育用胶化果白陈10g/L,细菌培育用酵母

提取物5g/L,NaCl10g/L,去离子水。

搅（拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml,

用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃,1.034X105pa高

压下蒸汽灭菌20mi.）

2）TE缓冲液:

IMTris溶液取（Tris242.2g,加dd%。至1600ml,加热溶解）

IMtris-HClpH8.0溶液取（IMTris溶液160ml用分析纯盐酸调至

Ph=8.0需（浓盐酸约8.5ml）,力ddH2O定容至200ml,高压灭

菌备用）

TE缓冲液（10mMTris-HClIMmEDTApH=8.0,IMTris-HCl

BufferPH=8.05ml

0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddHO匀称混

2

合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）

3）蛋白酶K：2（0mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-2CTC备用）

4)CTAB/NaCl溶液：(5%/v,5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl

溶液中，需加热到65。。使之溶解，然后室温保存)

4、试验方法步骤

1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培育基中，一级培育过夜，以10%的

接种量进行二级培育，培育至对数期(4-6h)o

2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心lmin,弃上清

液

3、加190ulTE悬浮沉淀，并加