免疫沉淀类实验讲课文档.pptVIP

第1页，共36页。在琼脂凝胶中，待检人血清IgG和羊抗人IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散，在比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线，证明两者发生特异性结合反应。实验原理第2页，共36页。试剂健康人血清，用生理盐水做1:5~1:40系列倍比稀释、羊抗人IgG抗血清、10~15g/L琼脂糖或琼脂粉。仪器水浴箱、温箱。材料载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、湿盒等。实验器材和材料第3页，共36页。制备琼脂凝胶：用生理盐水配置10～15g/L琼脂，隔水加热煮沸备用。浇板：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取4~4.5ml融化的琼脂倾注于玻片上，滴加时注意速度不要过快，要使琼脂盖满整张玻片，使其均匀、饱满，勿溢出并避免产生气泡。打孔：待琼脂凝固后，将梅花形打孔模板置于琼脂板下，用直径3mm的打孔器打孔，使其孔径为3mm，孔距为4mm，孔要求圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿与载玻片脱离。加样：用10μl微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体，周围孔分别加入不同稀释度的抗原。温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察沉淀线。实验方法第4页，共36页。操作示意图浇板温育打孔加样结果判断中央孔—抗体成分周围孔—不同稀释度的抗原成分（第1~5孔）第6孔—阴性对照123456第5页，共36页。以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为人血清IgG的扩散效价。结果判断第6页，共36页。北华大学王雪松该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清IgG的检测以外，还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测AFP、HBsAg等，但敏感度低所需时间长。实验讨论第7页，共36页。实验二单向免疫扩散试验第8页，共36页。将一定量的羊抗人IgG抗血清成分混合于琼脂凝胶中，制成含有特异性羊抗人IgG抗血清的琼脂板，待凝固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清IgG。使待检血清在琼脂板中向四周呈环状扩散，在两者浓度比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀环，沉淀环的直径或面积与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测人血清IgG浓度。实验原理第9页，共36页。实验器材和材料试剂：待检人血清、免疫球蛋白工作标准（IgG含量为10.10mg/ml）、羊抗人IgG抗血清（单扩效价1:100）、琼脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3。仪器：水浴箱、温箱。材料：载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、三角烧瓶、湿盒半对数坐标纸等。第10页，共36页。实验方法制备抗体琼脂凝胶:用生理盐水配置10～15g/L琼脂，加0.01%（0.1g/L）NaN3，隔水加热煮沸琼脂，置56℃水浴中备用。吸取99ml已融化的琼脂于三角烧瓶中，置56℃水浴中保温，将预温的羊抗人IgG抗血清1ml与琼脂充分混合，继续保温于56℃水浴中备用。浇板:将清洁干燥的载玻片置于水平台上，用吸管吸取充分混匀的抗体琼脂4~4.5ml倾注于玻片上，置室温冷却凝固。要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。打孔:待琼脂凝固后，用打孔器打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。要求孔打得圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿与玻片分离。第11页，共36页。加样:稀释人免疫球蛋白工作标准品：取冻干人免疫球蛋白工作标准品1支加蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为1:5、1:10、1:20、1:40，IgG相应含量为2020、1010、505、252mg/L。稀释待检血清：将待检血清用生理盐水做1:40稀释。用微量加样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品10μl加入到标准抗原孔，制备标准曲线。再用同样的方法吸取已稀释好的待检血清10μl加入到待检血清孔。扩散:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察结果。如果沉淀环不清晰，可用生理盐水浸泡2~3h。第12页，共36页。操作示意图浇板扩散打孔加样12345