显微技术原理与应用：从光学到电子显微镜.pdfVIP

第二章章节

2.1.显微技术。

2.1.1成像原理：光和电子都有波的行为，当光和电子转过透镜到达聚焦点时，由于波的干

涉而城乡。实际上通过透镜观察到的样品的景象是通过透镜波的累加和消除即衍射的结

果。波长越小，能够观察到的物体越小，分辨率越小。

2.1.2分辨率

R=0.61*波长/nsinan：聚光镜和物镜之间介质的折射率，空气为1，油为1.5，a为

样品对物镜孔径角的半角，sina最大值为1；

波长，照明光源的波长。

最大分辨率。区别两个点距离的能力，所以r值越小，分辨率越

——所以，如果，粒子波长越长，油镜，玻璃透镜的最大数值孔径为0.94.角孔径为70

度。

2.1.3分辨极限和放大率

分辨极限：其实就是能够清楚两点之间的最小间隔

放大率：物镜倍数X目镜倍数。

2.1.4常见光学显微镜的工作原理以及适用对象

普通显微镜：可见光源。

荧光显微镜：紫外光源。对象：研究胞内物质的吸收、以及化学物质的分布及定位。

相差显微镜：利用光衍射和使相位差变为振幅差。由于细胞不同部分的折射率不同，

通过细胞的光线比未通过细胞的光线相位。例如，通过细胞核的光线比通过细胞其他部

位的相位。射线之间互相，振幅发生变化。能够观察到无色透明活细胞中得结构

暗视野显微镜。使用特殊的照明方法，使光线不能进入物镜和目镜。这样，在观察样品时

就不能直接看到照明光线，而只能观察被检物体所反射或衍射的光线，因而在中呈现明

亮的像。这种照明方式，使反差增大，分辨率提高。能够观察到染色的和胶体粒子

倒置显微镜：原理与普通显微镜一样：通常对培养的细胞进行照明和观察

2.1.5样品：

固定：杀死细胞，稳定细胞的化学并且使样品硬化，方便进一步切片

包埋和切片：用液态石蜡和树脂渗入整块组织，然后硬化

染色：苏木精：负电荷

伊红：酸性，细胞质

苏丹：脂肪。

2.1.6用感光胶片测定细胞内某种性标记的物质在细胞固定时所在的位置。原理是利用

性同位素发出了的带电离子，作用于感光材料的卤化银晶体，从而可以产生潜影成像。

2.1.7常见电子显微镜

透射电镜（TEM）：真空系统，电子枪，电磁透镜，照相系统。

扫描电镜（SEM）：用极狭窄的扫描样品表面，引起样品的二次电子，产生样品

表面放大的形貌像，这种像是按照被扫描的时序建立的。二次电子被闪烁检测器捕获，

当闪烁检测器结合电子后就会发出光质子，这些质子可用于产生点信号。

扫描透射电镜（STEM）：既可扫描又可

高压电子显微镜：与透射电镜相同，但是电压高，所以会大大减少早成畸变的可能。

2.1.8电镜样品：

固定：样品要薄，不然电子无法

包埋切片：切片要薄这样子可以很好地保持样品的精细结构，而且需要样品有一定的

反差。切片是放在载网上而不是玻片上。

染色：负染，用重金属盐染色，电子密度高的重金属盐包埋了样品中迪电子密度的背

景，增强了背景散射电子的能力一提高反差。背景是的，而未被包埋的样品颗粒则透明

光亮。

喷镀：朝向加热丝一面被喷镀金属，因此在电镜下观察时，被金属覆盖得很暗，而未

被覆盖的则光亮。

2.1.9冷冻断裂复型和冷冻蚀刻

冷冻断裂复型：先将样品处于液氮中快速冷冻（但要防止冰晶），迅速抽真空，用冰刀横切

样品使样品的内层被分开露出两个表面。

冷冻蚀刻：将冷冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品在冰在真空中升华，而在表面上浮雕

出细胞膜的超微机构，然后用铂-碳复型。

2.1.10扫描隧道显微镜：量子力学中的隧道效应。探针使用钨丝和铂铱丝造成探针，当探针

足部近被测样品的时候，它们的电子云产生，此时在两者间加上一微小点样，电子就

可以从针尖一到样品，从而产生隧道电流。

2.1.11原子力显微镜（AFM），不要求样品导电。

2.1.12X射线成像

2.2细胞化学

酶细胞化学技术

免疫荧光：对抗原细