壳聚糖酶产生菌的选育、发酵调控及壳寡糖酶解制备工艺研究.docxVIP

壳聚糖酶产生菌的选育、发酵调控及壳寡糖酶解制备工艺研究

一、引言

1.1研究背景

壳聚糖（Chitosan）作为自然界中储量丰富的生物高分子，是甲壳素脱乙酰化的产物，学名为聚（1,4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。其具有无毒、可生物降解、良好生物相容性和成膜性等诸多优良特性，在农业、医疗卫生、食品等领域展现出广泛的应用前景。例如在农业领域，壳聚糖可作为植物生长调节剂，促进植物生长、提高植物抗病能力；在医疗卫生领域，可用于制备伤口敷料、药物载体等。然而，壳聚糖由于分子量大、水溶性较差，在人体内不易吸收，这在很大程度上限制了其进一步应用。

壳寡糖（Chito-oligosaccharides）作为壳聚糖的降解产物，是聚合度为2-20的低聚糖，它克服了壳聚糖的上述缺点，具有水溶性好、易吸收等优点，还具备许多独特的生理活性和功能。研究表明，壳寡糖能够调节肠道微生态，促进有益微生物的生长，抑制有害菌的繁殖；在增强免疫功能方面，可激活免疫细胞，提高机体的免疫力；还具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、保湿等显著特点，在医药、食品、化妆品、农业等领域展现出更为广阔的应用前景。

壳聚糖酶（Chitosanase）是一种能够以内切方式催化水解部分乙酰化壳聚糖中的β-1，4-氨基葡萄糖苷键的酶，其催化产物正是具有多种生物学特性的壳寡糖。因此，壳聚糖酶在壳寡糖的制备过程中起着关键作用。通过筛选和培育高产壳聚糖酶的菌株，优化其发酵条件，可以提高壳聚糖酶的产量和活性，进而高效制备壳寡糖，这对于充分发挥壳寡糖的功能特性，拓展其应用领域具有重要意义。同时，深入研究壳聚糖酶产生菌的相关特性，也有助于推动生物酶技术在多糖降解领域的发展，为解决壳聚糖利用难题提供有效途径。

1.2国内外研究现状

在壳聚糖酶产生菌育种方面，国内外学者已开展了大量工作。早期主要通过传统的自然突变、化学诱变、辐射诱变等方法对菌株进行改良。例如，利用紫外线、亚硝酸等诱变剂处理菌株，筛选出突变的高产菌株。近年来，随着基因工程技术的飞速发展，其在菌株改良中得到了广泛应用。研究者们通过基因敲除、基因组工程、基因突变等技术手段，对菌株的重要基因进行操作，从而获得更优秀的壳聚糖酶表达菌株。如通过基因编辑技术敲除菌株中影响产酶的负调控基因，或者过表达与产酶相关的关键基因，显著提高了壳聚糖酶的产量和活性。目前，已从多种微生物中筛选出壳聚糖酶产生菌，包括细菌、真菌、放线菌等，如芽孢杆菌属、曲霉属、链霉菌属等。

关于壳聚糖酶的发酵条件优化，国内外研究涉及多个方面。培养基配方的优化是关键环节之一，不同的菌株对培养基成分的需求存在差异。研究人员通过单因素试验、响应面试验等方法，对碳源、氮源、无机盐等成分进行筛选和优化，以提高壳聚糖酶的生产效率。例如，发现某些菌株在以壳聚糖为唯一碳源，以蛋白胨、酵母提取物等为氮源时，产酶效果较好。此外，pH值、温度、液体搅拌速度、氧气含量等发酵条件也对壳聚糖酶的产量和活性有重要影响。不同菌株的最适生长pH值和温度各不相同，合理调节液体搅拌速度和氧气含量，可满足微生物的代谢需求，提高产酶能力。发酵方式的选择也不容忽视，曝气式发酵、搅拌式发酵、气液固三相发酵等不同方式在壳聚糖酶生产中均有应用，通过选择合适的发酵方式，可提高壳聚糖酶的生产效率。

在壳寡糖的酶解制备方面，酶解反应方式主要有原位酶解方式和分离酶解方式。酶解条件的优化至关重要，包括酶的用量、反应时间、反应温度、反应pH值等参数的合理调节，能够提高壳寡糖的酶解效率。例如，研究发现，在一定范围内，增加酶的用量可加快酶解反应速度，但过高的酶用量会增加成本且可能导致酶解过度；合适的反应温度和pH值能使酶的活性得到充分发挥。壳寡糖的提纯和检测方法也不断发展，目前主要的提纯方法包括酸性离子交换层析、凝胶渗透层析、逆流凝胶渗透层析和亲和层析等，这些方法可有效去除杂质，提高壳寡糖的纯度；检测方法则有高效液相色谱、质谱、核磁共振等，用于准确测定壳寡糖的纯度和聚合度。

1.3研究目的与内容

本研究旨在筛选和培育高产壳聚糖酶的菌株，通过优化发酵条件提高壳聚糖酶的产量和活性，并利用获得的壳聚糖酶高效制备壳寡糖。具体研究内容如下：

壳聚糖酶产生菌的筛选与育种：从土壤、海洋等环境样品中分离筛选壳聚糖酶产生菌，通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法对筛选得到的菌株进行鉴定。采用传统诱变方法和基因工程技术对菌株进行改良，提高其产壳聚糖酶的能力。例如利用紫外线诱变处理菌株，然后在含壳聚糖的平板上筛选透明圈直径与菌落直径比值较大的突变株；运用基因工程技术将高效表达的壳聚糖酶基因导入合适的宿主菌株中，构建高产工程菌株。

壳聚糖酶发酵条件的优化：对筛选得到的高产菌株进行发酵条件优化，包括培养