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基于酵母双杂交技术筛选BACE1相互作用蛋白的研究

一、引言

1.1研究背景

β淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（β-siteAPPcleavingenzyme1，BACE1），又被称作β分泌酶或膜相关天冬氨酸蛋白酶2，在阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）的病理机制中占据关键地位，是AD研究领域的焦点分子。

从AD的发病机制来看，目前得到广泛认可的是淀粉样蛋白级联假说。该假说指出，淀粉样斑块在脑组织中的沉积是AD发病的关键病理机制。BACE1作为淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein，APP）淀粉样降解途径中的限速酶，其主要功能是在APP的Met596-Lys597位点（β位点）进行切割，产生含N端的β-APPs（β-分泌酶产物）和C端片段C99，C99随后会进一步被γ分泌酶切割，生成β-淀粉样蛋白（β-amyloidprotein，Aβ），而Aβ正是淀粉样斑块的主要成分。大量研究显示，AD患者大脑中BACE1的浓度和活性显著增加，这会促使Aβ的大量产生和聚集，进而引发神经炎症、神经元凋亡以及突触丢失等一系列病理变化，最终导致认知功能障碍。例如，在对AD患者的大脑组织样本进行检测时，发现BACE1的表达水平明显高于正常人，并且其活性也显著增强，这与AD患者大脑中淀粉样斑块的大量沉积以及病情的严重程度密切相关。在APP/PS1+BACE1双转基因小鼠模型中，由于BACE1的过表达，小鼠大脑中出现了典型的AD病理特征，如大量的淀粉样斑块沉积和神经元损伤，同时小鼠也表现出明显的认知功能下降。

除了在AD中的关键作用，BACE1在其他生理病理过程中也具有重要意义。在正常生理状态下，BACE1参与神经递质受体的调控。研究发现，BACE1能够切割AMPA受体亚基GluA2，这一过程对突触可塑性有着重要影响，而突触可塑性对于学习和记忆等认知功能至关重要。BACE1还参与Notch受体的切割，在神经发育过程中发挥关键作用，影响神经细胞的增殖、分化和迁移等过程。在糖代谢方面，敲除BACE1的小鼠表现出胰岛素敏感性增强，这表明BACE1可能参与葡萄糖代谢的调控，尽管其具体机制目前尚不明确。在病理状态下，BACE1的异常表达和活性改变与多种神经系统疾病相关。一些研究发现，在帕金森病患者的大脑中，BACE1的表达水平也有所升高，并且与疾病的进展存在一定关联。

蛋白质之间的相互作用在蛋白质参与的各种生物学过程中发挥着重要作用，BACE1也不例外。BACE1的相互作用蛋白可以通过多种方式对BACE1进行调节，从而影响AD的发生与疾病进程。这些相互作用蛋白可以直接与BACE1结合，改变其空间构象，进而影响其酶活性；也可以通过间接结合，或者参与各种细胞信号转导通路，在BACE1的转录、翻译、修饰、胞内运输等各个环节发挥调节作用。研究BACE1的相互作用蛋白，对于深入理解BACE1的生理功能和作用机制，以及揭示AD的发病机制都具有重要意义。通过鉴定与BACE1相互作用的蛋白，能够为开发AD的新治疗靶点提供关键线索，为AD的治疗开辟新的途径。

1.2酵母双杂交技术概述

酵母双杂交技术作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的经典方法，自1989年由Fields和Song首次提出以来，已经在生命科学领域得到了广泛应用和不断发展，为解析蛋白质互作网络和揭示生命过程的分子机制提供了强大的技术支持。

酵母双杂交技术的核心原理基于转录因子的模块化特性。许多真核生物的位点特异转录激活因子通常包含两个可分割的结构域：DNA结合结构域（DNA-bindingdomain，BD）和转录激活域（Transcriptionalactivationdomain，AD）。这两个结构域在功能上相互独立，但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时具备这两个结构域，否则无法完成激活功能。在酵母双杂交系统中，将诱饵蛋白（已知蛋白）与BD融合，猎物蛋白（待测蛋白）与AD融合，然后将这两个融合蛋白共表达于同一个酵母细胞内。如果诱饵蛋白和猎物蛋白之间能够发生相互作用，它们就会通过桥梁作用使AD与BD在空间上靠近，形成一个完整的转录激活因子，进而激活相应报告基因的表达。通过检测报告基因的表达情况，就可以判断诱饵蛋白和猎物蛋白之间是否存在相互作用。常用的报告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等，相应的酵母菌株具有这些基因的缺陷型，只有当报告基因被激活表达时，酵母细胞才能在特定的营养缺陷培养基上