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注射Kainate诱导大鼠海马中caspase-12的表达

摘要目的:注射Kainate诱导的大鼠边缘叶发作模型.检测caspase-12大鼠海马神

经元表达。方法：立体定位海马注射Kainate诱导诱导激活海马内的KAI受体后，

以持续记录脑电、局部脑血流（rgionalcerebralbloodflav，rCBF),用TUNEL染色和

ciesylviolet染色观察海马神经元存活和凋亡；用免疫荧光和Westernblot检测海

马caspast-12的表达。结果：4h时caspase-12出现裂解片段，8h时出现TUNEL

阳性细胞，24h时达高峰。脑室内注射caspase-12抑制剂

zrLEHrHluoKmettylketoneCzrLEHDfmk)可减少TUNEL阳性细胞，增加存活神经元；

后在KA注射同侧海马的CA3区神经元caspasd免疫反应性增强；对侧海马未见

TUNEL阳性细胞及caspase-12的上述变化。发作前后rCBF无明显变化。结论：

Kainate可诱导KAI的激活。caspase-12可能是KAI的靶点，也可能是神经元损伤

的潜在靶点。

关键词Kainate；海马；caspase-12

aspase-12属于Caspase第一家族（又称白细胞介素1-β转换酶家族），主要

存在于细胞内质网中，在全身多种器官组织细胞中均有表达[1]。Caspase-12主要

由三大部分组成：前区域，大亚基和小亚基。在此三部分之间又存在着几个不同

区域，例如Caspase区域和Caplain区域等。Caspase-12前体（proCaspase）通过

不同激活途径切割不同区域被激活，可引起Caspase其它家族成员，如Caspase-

3,9活化，通过诱导激活下游死亡因子，如Lamin、Rb、PARP等，最终导致细胞

凋亡[2-3]。caspase-12是细胞凋亡线粒体通路的重要启动酶，在线粒体凋亡通路

中，KAI一旦释放即与细胞凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptoticproteaseactivating

factolr1Apaf-1)结合，在dATP/ATP存在条件下活化caspase-12，caspase-12再激

活下游效应。caspase(caspase-3、caspase~6或caspase-7)，诱导细胞凋亡。以往

研究发现caspase12的细胞内线粒体途径参与了缺血性脑损伤和癫痫致脑损伤的

凋亡[4]。但caspase-12介导的发作致脑损伤是否与脑缺血有关尚未见报道，我们

检测了发作前后大鼠局部脑血流（regionalcerebralbloodflow，rCBF)的变化，观

察发作诱导的神经元凋亡与脑血流的关系，分析caspase-12可能机制。

1.材料与方法

模型的建立，建立单侧杏仁核内注射KA诱导的大鼠边缘模型。取SD雄性大

鼠60只（长沙医学院基础医学院提供）体重250~320g。水合氯醛0.3g/kg-1腹腔

注射后，2%利多卡因双侧外耳道表面麻醉;将大鼠背位固定于立体定位仪上，股

静脉插管备用地西泮。根据Paxionswatrson图谱确定杏仁核给药部位，AP：—

2.8mm,RL：—4mm,H：8mm。以微量注射注入Kainate(0.5g溶于0.5PBS缓冲液中，

pH值调至7.4)，6只大鼠脑室内注射caspase-12抑制剂zrLEHD-fmk(0.8%，于

Kainate注射前20、5min及KA注射后1、12h分4次给药）rCBF采用

LDF100CCBioPACsystemsMP150连续监测，监测部位在(AP=—4mm,L=4mm)处的硬

脑膜表面，相当于Kainate注射部位同侧颞叶，记录Kainate注射前10min的

r~CBF为基线，注射后每隔10min记录一次，脑灌注率以占相应基线的百分率的

均值表示。术中采用电热毯保温，保持大鼠肛温37~37.5°C。

1.1动物分组

正常对照组（6只）：杏仁核注射PBS(36只）：杏仁核内注射Kainate(0.5ml

作溶于PBS0.5ML缓冲液中，pH值调至7.4)，1h后经股静脉注射地西泮

30mg/kg—1，根据处死大鼠的时间点分0、2、4、8、24、72h6组，每组6只；

试验给药组（6只）z-LEHD-fmk(脑室）+Kainate(杏仁核内）实验