药学本科分子生物学实验指导.pdfVIP

实验项目一：总RNA的提取（必做）

一、实验学时：6学时

二、实验目的

通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。

三、实验内容

利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和

DNA。

四、实验要求

学会提取基因组RNA的方法和操作过程

提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应

用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethylpyrocarbonate，DEPC)处理。

塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用

0.1%DEPC处理。

五、实验所需仪器设备与试剂

仪器：移液器及吸头，电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量

移液枪等

试剂：TRIzol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇（DEPCH2O配制）、

DEPCH2O

六、实验原理

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。最大特点是可

同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂

解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水

相用异丙醇沉淀可回收RNA；

七、实验步骤

1.颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏

2.将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液

3.将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，

4．冷冻离心机冷却到4℃（预冷半个小时）。准备冰盒。

5．戴口罩，戴手套。

6.每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mLTrizol试

剂，

7.超声破碎仪破碎细胞

8.剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。

9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5

分钟。

10.离心：4℃，13,000rpm，10min。

11．取新EP管。将上层水相（约600uL）加入新EP管，

12.再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。

13.离心：4℃，13,000rpm，10min。

14.去上清夜，加入20-30uLDEPC水，55℃10min，以完全溶

解RNA。

15.-70度保存提取的总RNA。

八、注意事项

1．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA

酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。

2．RNA提取用品准备：

1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，

试剂瓶若干个。

2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然

后高压灭菌，烘干。

3）用烘烤过的药勺称取试剂。

4）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37℃至少处理12小时，

高压灭菌15min。

实验结果:成功从植物中分离得到总RNA

实验项目二：总RNA的纯化和鉴定（必做）

一、实验学时：6学时

二、实验目的

通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法

三、实验内容

1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。

2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA

四、实验要求

1、学会纯化植物总RNA的方法

2、学会定量、定性检测RNA的方法

五、实验所需仪器设备

移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,

恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、

紫外分光光度计

六、实验原理

乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。

在阳离子的足量时，可以中和暴露的磷酸残基的电荷，使RNA沉淀。

反复利用乙醇沉淀RNA，可以起到纯化RNA的作用。

由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，总RNA电泳后UV下应能看到

非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相

当于28S和1