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发根农杆菌介导山定子转化及植株再生体系构建的深度解析

一、引言

1.1研究背景

山定子（Malusbaccata(L.)Borkh.），作为蔷薇科苹果属的落叶乔木，在果树研究领域占据着至关重要的地位。其广泛分布于我国的华北、东北、西北等地区，具有卓越的耐寒、耐旱以及耐瘠薄能力，是苹果属植物中极具价值的野生资源。山定子不仅能够适应多种土壤类型，包括沙土、壤土和黏土，还与许多果树品种展现出强大的嫁接亲和力，使得嫁接成活率颇高。正因如此，山定子成为了苹果栽培中不可或缺的优良砧木，对于提升苹果的产量与品质，增强其抗逆性能，发挥着关键作用。

随着现代生物技术的飞速发展，植物基因工程为果树遗传改良开辟了崭新的道路。发根农杆菌介导转化技术作为植物基因工程领域的重要手段，已在众多植物的遗传转化中得到广泛应用。发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）属于根瘤菌科农杆菌属的革兰氏阴性土壤细菌，它携带的Ri（rootinducing）质粒在侵染植物的过程中，其上的T-DNA片段能够插入植物基因组，进而使植物产生毛状根。这些毛状根具备生长迅速、激素自养、分化程度高以及遗传性状稳定等显著特点，为植物基因功能研究、次生代谢产物生产以及遗传改良等方面提供了强大的技术支撑。在过去的研究中，发根农杆菌介导转化技术已成功应用于丹参、怀地黄等多种植物，实现了次生代谢产物的高效生产和遗传性状的改良。然而，将发根农杆菌介导转化技术应用于山定子的研究仍相对较少，其转化体系尚不完善，这在一定程度上限制了山定子在果树遗传改良和生物技术研究中的深入应用。

1.2研究目的与意义

本研究旨在深入探究发根农杆菌介导山定子转化的关键影响因素，全面优化转化体系，从而显著提高山定子的生根能力，并成功建立高效稳定的植株再生体系。这一研究具有多方面的重要意义：

在理论层面，发根农杆菌介导山定子转化及植株再生体系的建立，能够为深入研究山定子的基因功能和遗传特性提供坚实的技术基础。通过该体系，科研人员可以精准地将外源基因导入山定子基因组，进而深入研究基因的表达调控机制以及基因与性状之间的关联，为山定子的遗传改良提供深入的理论依据。

在实践应用方面，提高山定子的生根能力，能够有效提升其作为苹果砧木的嫁接成活率和生长势。根系发达、生根能力强的山定子砧木，能够更好地吸收养分和水分，为接穗提供充足的营养支持，从而显著提高苹果的产量和品质。建立高效的植株再生体系，有助于快速繁殖优良的山定子品种，为苹果产业的发展提供丰富的优质种苗资源，有力推动果树产业的可持续发展。此外，该研究成果还能够为其他木本植物的遗传转化和植株再生研究提供宝贵的借鉴和参考，促进整个植物生物技术领域的进步与发展。

1.3国内外研究现状

发根农杆菌介导的植物转化技术自问世以来，便受到了国内外科研人员的广泛关注。在山定子相关研究中，国内外学者已开展了一系列探索。国外研究较早关注到发根农杆菌对植物的转化作用，但针对山定子的研究相对较少。早期研究主要集中在发根农杆菌菌株的筛选和转化条件的初步摸索上，通过对不同菌株的比较，发现某些菌株对山定子具有一定的转化能力，但转化效率较低，且转化体系不稳定。

国内研究在发根农杆菌介导山定子转化及植株再生方面取得了一定进展。武姣等人用发根农杆菌转化山定子，对不同发根农杆菌株系、培养基，共培养时间以及添加乙酰丁香酮（AS）进行研究，优化了发根农杆菌转化体系，当用添加AS（100μmol?L?1）的菌液侵染植株切段30分钟，共培养3d，在无激素的固体1/4MS培养基上诱导发根时，发根诱导率最高，达到88.89％。发根再生通过诱导愈伤组织获得再生植株和发根通过器官发生途径直接再生植株两个途径进行，并对影响发根再生的多种激素进行筛选，得到了较高再生率的培养基配方。然而，当前研究仍存在一些不足和待解决问题。一方面，虽然已对部分转化条件进行优化，但整体转化效率仍有待进一步提高，以满足大规模遗传转化的需求。另一方面，对于发根农杆菌介导山定子转化的分子机制研究还不够深入，对转化过程中基因的整合、表达及调控机制了解有限，这限制了转化技术的进一步优化和应用。在植株再生体系方面，再生植株的质量和稳定性还需进一步提升，再生过程中的变异问题也需要深入研究和解决。

二、发根农杆菌及转化机制

2.1发根农杆菌的特性

发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）属于根瘤菌科农杆菌属，是一种革兰氏阴性土壤细菌。其细胞呈棒状，大小约为0.8微米×（1.5-3.0）微米，周身具1-4根鞭毛，凭借这些鞭毛，发根农杆菌能够在土壤环境中灵活运动，以寻找合适的宿主植物。作为土壤习居菌，发根农杆菌主要栖息于曾有多种植物生长过的土壤中，偏好氧气充足的环境，