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核酸的提取与制备

(一)蛋白酶K消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包

括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌物、尿，粪便等.

1.试剂配制

①蛋白酶K消化液:10mmol/LTris.cl(PH8.0)

10mmol/LEDTA

150mmol/LNaCL

0.5%SDS

100～200ug/ml蛋白酶K.

②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.

2.提取方法:

有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组织

块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.

临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时，或

37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一次，上清

加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇(或加

等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸弃或倒出上清，

沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的吸弃或倒掉上清，

真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul用于PCR扩增，或放-20℃

保存.

蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理

后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增.如

杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除彻底，

Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.

(二)直接裂解法:标本(组织细胞，分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后，加消化裂

解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐温-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原体，裂解细

胞.然后12000r/min离心5～10min，取上清20～30ul用于PCR扩增.血清标本可直加等体

积的消化液，加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解液，95℃

30min消化处理，离心取上清，PCR扩增检测HBVDNA.

(三)碱变性法:取血清20ul，加入1mol/LNaOH20ul，37℃30min，离心，加1mol/L

HCl20ul，离心后，取上清5ul，用于PCR扩增.*亦有用10ul血清加NaOH至0.2mol/L，37℃

1h，再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR，其特异性和敏感性较前法更好.

(四)煮沸法:经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸馏水或

PBS，混匀后，100℃煮沸10～15min，14000r/min10min，取上清做PCR.

(五)碘化钠法:取组织细胞及抗凝血液10～100ul，加等体积的6MNaI，反复轻混

20s，加等体积氯仿:异戊醇(49:1)振匀后，离心取上清加0.6体积的异丙醇，混匀后置室温

3min.14000r/min10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有用100ul

血清加裂解液300ul(6MNaI，0.5%十二烷基肌酸钠，10ug糖原，26mmol/LpH8.0Tris-HCL，

13mmol/LEDTA)混匀后，60℃15min，加等体积异丙醇，离心沉定后，加TE液用于PCR

扩增，其产量和质量较高.

(六)异硫氰酸胍法

此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等.

1.异硫氰酸胍消化液

异硫氰酸胍4mol/L

柠檬酸钠(PH7.0)25mmol/L

十二烷基肌酸钠0.5%

β-巯基乙醇0.1mol/L

2.消化方法:用50～100u