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菌种培育基础知识点

菌种的概念与重要性

菌种是用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等。优质菌种如同良种对于农业生产，是发酵工业成功的关键。它决定了发酵产品的产量、质量和成本。例如，在酿酒过程中，合适的酵母菌种能产生独特风味和高酒精度的美酒；在抗生素生产里，优良菌种可大幅提高产量，降低生产成本。

菌种的来源与筛选

自然界是菌种的巨大宝库。土壤、水体、动植物体表及体内等都是微生物栖息的场所。筛选菌种一般需经过采样、富集培养、分离纯化、初筛和复筛等步骤。

-采样：根据所需菌种特性选择合适的采样地点。如寻找耐高温淀粉酶产生菌，可从高温环境如温泉、堆肥中采样。

-富集培养：通过控制培养基成分和培养条件，使目标菌种在混合菌群中优势生长。例如，利用以纤维素为唯一碳源的培养基富集纤维素分解菌。

-分离纯化：常用的方法有平板划线法、稀释涂布平板法等，将混杂的微生物分开，获得单个纯种菌落。

-初筛和复筛：初筛以快速、简便的方法从大量分离菌株中筛选出具有目标特性的菌株；复筛则对初筛得到的菌株进行更精确的性能测定，确定最佳生产菌种。

菌种的保藏

为保持菌种的活性和遗传稳定性，需进行妥善保藏。常见的保藏方法有以下几种：

-斜面低温保藏法：将菌种接种在合适的斜面培养基上，培养后置于4℃左右冰箱保存。该方法简单，但保藏时间较短，一般几个月需转接一次，期间菌种可能发生变异。

-液体石蜡保藏法：在长满菌种的斜面上加入无菌液体石蜡，使菌种与空气隔绝，降低代谢活动。可延长保藏时间至1-2年，适合霉菌、酵母菌等。

-冷冻干燥保藏法：将菌种制成菌悬液，在低温下迅速冻结，然后在真空条件下升华脱水，使细胞处于休眠状态。该方法保藏时间长，可达数年甚至数十年，且能较好保持菌种原有特性，但设备要求高，操作复杂。

-液氮保藏法：将菌种悬浮于含保护剂的溶液中，放入液氮罐（-196℃）保存。是目前最有效的保藏方法之一，能长期稳定保藏菌种，但需昂贵的液氮设备和定期补充液氮。

菌种的扩大培养

从保藏的少量菌种开始，逐步扩大培养规模，以满足发酵生产的需求。

-实验室阶段：一般从斜面菌种开始，转接至摇瓶液体培养基中，在合适的温度、转速等条件下振荡培养，使菌种大量繁殖。

-种子罐阶段：当摇瓶培养的种子液达到一定浓度后，接入种子罐进行扩大培养。种子罐体积较大，需严格控制温度、pH、溶解氧等条件，确保菌种生长良好。通常经过一级种子罐、二级种子罐等逐步扩大培养规模。

-发酵罐阶段：种子罐培养的种子液达到规定的菌体量和质量后，接入发酵罐进行大规模发酵生产。发酵罐的条件控制更为严格和复杂，不同的发酵产品和菌种对发酵条件要求差异很大。

菌种的退化与复壮

在菌种传代过程中，可能出现退化现象，表现为生产性能下降、形态特征改变等。其原因主要有基因突变、连续传代和培养条件不适等。

-退化的检测：通过定期测定菌种的发酵性能、形态特征等指标来判断是否退化。例如，若抗生素生产菌种的发酵单位持续下降，可能发生了退化。

-复壮的方法：主要有纯种分离、通过宿主体内复壮等。纯种分离可采用平板划线法或稀释涂布平板法，从退化菌种中分离出未退化的优良菌株；通过宿主体内复壮适用于寄生性微生物，如将退化的病原菌接种到敏感动物体内，再从动物体分离出恢复活力的菌株。

无菌操作技术

在菌种培育全过程中，无菌操作至关重要，防止杂菌污染。

-环境无菌：接种室、超净工作台等操作环境需定期用紫外线照射、化学消毒剂擦拭等方法消毒。

-器具无菌：培养基、接种环、培养皿等实验器具需经高压蒸汽灭菌、干热灭菌等方法彻底灭菌。

-操作规范：操作人员需穿戴无菌工作服、口罩和帽子，在火焰旁进行接种等操作，避免杂菌进入菌种培养体系。