荧光免疫技术专家讲座.pptxVIP

第八章荧光免疫技术;第二节荧光抗体技术

一、标本制作

二、荧光抗体制备

三、荧光抗体染色与结果判断

四、荧光显微镜基本结构

第三节荧光免疫分析类型

一、时间分辨荧光免疫测定

二、荧光偏振免疫测定

三、荧光酶免疫测定

;第四节荧光免疫技术在医学检验中应用

一、荧光抗体技术应用

二、荧光免疫测定应用

思索题

小结;

第一节概述

;荧光（fluorescence）;发射光谱和激发光谱;荧光效率;荧光寿命;荧光淬灭;荧光偏振;荧光物质;

第二节荧光抗体技术

;荧光抗体技术基本原理;荧光抗体技术内容;抗体要求;有能与蛋白质形成共价健化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合色素及其降解产物易于去除。

荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高荧光效率。

荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明。

与蛋白质结合后不影响蛋白质原有生化与免疫性质。

标识方法简单、安全无毒。

与蛋白质结合物稳定，易于保留。;抗体荧光素标识;去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤

去除荧光素未结合和结合过分抗体：阴离子交换层析法

去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收;荧光素与蛋白结合率：

F/P=

抗体效价：双向免疫扩散试验

抗体特异性：吸收试验、抑制试验

抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释;-20℃：保留1～2年

真空干燥：长久保留;组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最惯用）

印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织

涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液

培养细胞：单层培养细胞;冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清楚。

石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。;固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃;直接法;;双标识法;设置试验对照:阳性对照和阴性对照

区分特异和非特异染色

阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型;“-”：无或仅见极微弱荧光。

“+”：荧光较弱但清楚可见。

“++”：荧光明亮。

“+++”：刺眼强荧光。

特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。

依据呈++血清最高稀释度判定特异性抗体效价。;荧光显微镜;光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯

滤光片：隔热、激发和吸收滤光片

光路：透射光、落射光

聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器

镜头：消色差镜头;隔热滤光片：阻断红外线经过而隔热。

激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长光域，提供适当激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射荧光透过，保护眼睛。;透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。

落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。;

第三节荧光免疫分析类型

;荧光免疫分析基本原理;荧光抗体技术;荧光免疫测定方法类型;自发荧光寿命短:1ns～10ns

镧系元素寿命长:10μs～1000μs

短寿命荧光完全衰变后再测定镧系

元素特异荧光;stokes位移:激发光谱和发射光谱波长差

镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱

和发射光谱不重合;发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少

激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高;比活性：单位时间每个标识分子被探测信号量

荧光激发光源1000次/S激发，比活性提升;结合β-二酮体;镧系元素

铕(Eu3+)（最惯用）

钐(Sm3+)

铽(Tb3+)

钕(Nd3+)

镝(Dy3+);标识方法;方法类型;方法类型;方法类型;方法类型;灵敏度高：最小检出量10-18mol/L

分析范围宽：4～5个数量级

标识物稳定：有效使用期长

测量快速，易自动化

易受污染，本底增高;光线经过偏振滤光片后，

形成一个方向平面光称

为偏振光。;抗原抗体竞争反应

AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱

AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强

若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱

待检抗原含量与偏振荧光强度成反比;方法评价;基本原理;酶和荧光底物;方法类型;方法类型;方法类型;方法类型;方法评价;

第四节荧光免疫技术在医学检验中应用

;①本身抗体检测;②病原体检测;③免疫病理检测;④细胞表面抗原和受体检测;时间分辨荧光免疫测定：

蛋白质、激素、药品、肿瘤标识物、病原体抗原/抗体等

荧光偏振免疫测定：

药品、维生素、激素、常规生化项目等

荧光酶免疫测定：

病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等;1．荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭概念是什么？

2．惯用荧光物质有哪些？

3．荧光免疫技术有哪些类型？

4．荧光抗