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DNA定点突变实验具体步骤及详细说明

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可

以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），

包括碱基的添加、删除、点突变等。

一、引物设计

每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp，设计的突变位

点需位于引物中部。

二、反应

1.使用高保真的pyrobestDNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。

2.反应体系：

（1）10xpyrobestBuffer：5ul

（2）dNTPMixture(10mM)：1ul

（3）模板DNA(5~50ng)：1ul

（4）primer1(125ng)：1ul

（5）primer2(125ng)：1ul

（6）pyrobestDNApolymerase（TaKaRa）(5U/ul)：0.25ul

（7）加无菌蒸馏水至50ul.

三、产物沉淀纯化

1.加1/10体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）

5min