三种苦豆子类生物碱抗乙型肝炎病毒作用及其机理研究.pdfVIP

，}，闪药科人学硕1:学位论文种苦豆了类生物碱抗乙NO汗炎病毒作川及其机理初探

2.3.1给药方法及剂量

IiepG22.2.15细胞稀释液O.15m)/孔接种24h后吸出卜清，根据颅实验结果按如

I`加药方案4%孔板II，加入药物或无药物培养液O.lml:;参总碱浓度为10,5,2.5,

1.25,0.625,0.31mg·ml-1,氧化苦参碱浓度为20,10,5,2.5,1.25,0.625mg·ml

一’，苦参碱浓度为4,2.4,1.44,0.86,0.518mg·ml’，拉米夫定的浓度为2,1.6,

0.8,0.4,0.2,0.1，0.05mg·ml一’，然后每孔再Jai入无G4181640培养液0.15m1,r;k

浓度T{复6孔。

培养93h后，将上清吸出，加入0.25%的MTT液0.03ml,370C0.5%COZ继续培养

3h，甩干培养板，加入二甲亚矾0.1Oml，在微量台式振荡器上振荡1Omin,然后用酶

标仪读出并记录每孔492/630nm的吸光值，观察药物对细胞的毒性，实验重复3次。

2.3.2结果计算

计算药液每浓度复孔的平均吸光度值，.以无药物细胞对照组的平均吸光度值为

100%，计算各浓度下的抑制率，然后按Reed-Meuench法计算TC5ot半数毒性浓度):

TC5o=Antilog(B十(50-50%抑制百分率/50%抑制百分率一50%抑制百分率)xC)

式中，A=log50%药物浓度;;B=log50%药物浓度;;C=A-B

2.4对细胞分泌的HBsAg,HBeAg的抑制实验

2.4.1加药方案及剂量

每毫升45x100个HepG22.2.15细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5m1,并加入

0.5ml无G418的1640培养液，370C5%CO:培养24h后，收集上清，根据预实验结

果，加入接近无毒浓度及以下的三种碱的稀释液0.5ml，再加入无G4181640培养液

0.5m1使其终浓度为:苦参总碱1.0,0.5,0.25,0.025mg-ml-1;氧化苦参碱2,1,0.5

mg-MII;苦参碱0.5,0.25,0.025mg-ml1:拉米夫定31.25,6.25,1.25,0.25[g·ml

一’。370C5%CO:培养，每3d收取上清液，换原浓度药液继续培养，共加药培养9天。

将收集的培养液-20℃保存，同批测定HBsAg和HBeAg。实验同时设3-4孔无药物细

胞对照，实验重复3次。

2.4.2HBsAg和HBeAg侧定

按试剂盒说明书的方法用酶联免疫诊断试剂盒同批测定。

2.4.3结果的计算及统计

记录无药物细胞对照及给药组各浓度每孔吸光值，以无药物细胞对照组的平均吸

光度值为100，无细胞对照孔吸光值为空白对照，计算药物各浓度的抑制百分率(%)，

公式如下:

药物抑制HBsAg(或HBeAg)百分率(%)一(无药细胞对照吸光值一给药组吸光值)

/(无药细胞对照吸光值一空白对照吸光值)x100

药物抑制HBsAg(或HBeAg)的半数抑制浓度((1C50)-1Cso=Antilog(B+(50-50%

一10-

中国药科人学硕卜学位论文毛TIP7i4T类生物碱抗Z.!WIF炎病diY)JI)及1机〔A..If/lW

抑制百分率150%抑制百分率一50%抑制11分率)XC)

式’11,A=log50%药物浓度;B=log50%药物浓度;C=A-B

选扦指数(SI):T=-SI数毒性浓度(TC5o)11`数抑制浓度(IC5o)

统计3次实验的结果，以平均值土标准差(x士.、)表示，组介】‘I检验统计药物各

浓度的HBsAg,HBcAg和无药细胞对照组之PI1吸光值的差别。

3实验结果

3.1对HepG22.2.15细胞的毒性实验结果

三种苦豆子碱和拉米夫定对HepG22.2.15细胞的三次毒性实验结果TCsoTC5,

TCo)见Tabl.1:

Tabl.lToxicityofthreealkaloidsandlamivudineonHepG22.2.15cells(x士s,n=18)

DrugTC5o(mg-ml-1)TC5(mg-ml-1)TCo(mg-ml)

Banlangen1.76