DB64∕T 1683-2019 肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌0157：H7的快速检测方法.docxVIP

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X04

DB64

宁夏回族自治区地方标准

DB64/T1683—2019

肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌0157:H7的快速检测方法

2020-03-17实施2019

2020-03-17实施

宁夏回族自治区市场监督管理厅发布

I

DB64/T1683—2019

前言

本标准是按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。

本标准由宁夏回族自治区食品检测研究院提出。

本标准由宁夏回族自治区市场监督管理厅归口并组织实施。

本标准起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏回族自治区食品药品审评查验中心。

本标准主要起草人：邓军、夏莉娟、高俊峰、冯秀娟、李雯、董川、赵艳。

DB64/T1683—2019

1

肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌

和大肠埃希氏菌O157:H7的快速检测方法

1范围

本标准规定了肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌检测的环介导恒温核酸扩增(LAMP)的方法。

本标准规定了肉与肉制品中大肠埃希氏菌0157:H7检测的环介导恒温核酸扩增(LAMP)的方法。本标准适用于肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检测。

本标准适用于肉与肉制品中大肠埃希氏菌0157:H7的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB4789.30-2016食品安全国家标准食物微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验

GB4789.36-2016食品安全国家标准食物微生物学检验大肠埃希氏菌0157:H7/NM检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3缩略语

DNA(deoxyribonuclelcadd):脱氧核糖核酸。

dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate):脱氧核苷三磷酸。

LAMP(loop-mediatedisothermalamplification):环介导恒温扩增。

rfbE:肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7菌株特有的毒力基因

TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚。

virR:单核细胞增生李斯特氏菌致病因子编码基因。

4生物安全措施

按照GB19489中的有关规定执行。

5防污染措施

防止污染措施应符合GB/T27403的规定。

6原理

2

DB64/T1683—2019

利用环介导恒温扩增(LAMP)技术进行单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7的筛选检测。根据单核细胞增生李斯特氏菌特有的virR基因序列(参见附录A),大肠埃希氏菌0157:H7特有的rfbE基因序列(参见附录B)分别设计一套特异性引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域。利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，分别在单核细胞增生李斯特氏菌virR特异基因序列，大肠埃希氏菌0157:H7rfbE特异基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成很多类似花椰菜结构的茎环DNA混合物。当发生扩增反应时，反应体系中添加的染色剂(SYBRGreenI)能以嵌入方式结合到扩增出来的DNA混合物小沟处，随着双链DNA的增加，SYBRGreenI染料荧光信号随之增强，通过荧光定量PCR仪实时监测产物扩增情况，从而达到检测目的基因是否得到扩增。根据Ct值以及是否有“S”型扩增曲线判定结果。

7试剂与材料

7.1引物

PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定。

表1PCR反应使用的引物序列

菌株

目标基因

引物

名称

序列(5-3)

扩增片段大小(bp)

单核细胞增生李斯特氏菌

virR基因

F3

GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT

216

B3

ACAAGACTTCACCAATCCA

FIP

CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTT

GTTCG

BIP

TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTA